MTDH通過Wnt信號通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對膀胱癌細(xì)胞功能學(xué)影響的機制研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，臨床上，膀胱癌多采用腫瘤切除，術(shù)后輔助化療。然而，由于膀胱癌的高轉(zhuǎn)移性，膀胱癌的復(fù)發(fā)率及死亡率仍然很高。故研究膀胱癌的轉(zhuǎn)移機制是很有必要的。MTDH是近年來發(fā)現(xiàn)的癌基因，已有報道其在惡性腫瘤中表達(dá)較高。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，易于侵襲轉(zhuǎn)移的特性，其經(jīng)典上皮標(biāo)志物為E-cadherin。有報道顯示，在惡性腫瘤中，MTDH可促進(jìn)EMT發(fā)生，而EMT是膀胱癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因。目前，

2、在膀胱癌中尚無MTDH與EMT的相關(guān)研究。本研究擬通過分析在膀胱癌組織及細(xì)胞中MTDH與E-cadherin的表達(dá)關(guān)系，探討MTDH與EMT是否存在某種聯(lián)系，進(jìn)而采用基因沉默及過表達(dá)技術(shù)，深入研究MTDH對EMT的影響，及MTDH促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機制。
　　第一部分 MTDH和E-cadherin在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　檢測MTDH、E-cadherin在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

3、，探討MTDH、E-cadherin與臨床病理特征的關(guān)系，以及MTDH與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.應(yīng)用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）SP法檢測膀胱癌組織中MTDH和EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平。分析MTDH、E-cadherin蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，Spearman’s法分析MTDH與E-cadherin表達(dá)可能存在的相關(guān)性。
　

4、　2. Real-time PCR方法檢測MTDH與E-cadherin在膀胱癌細(xì)胞株、尿路上皮細(xì)胞株中mRNA的表達(dá)水平。
　　3. Western blot方法檢測在膀胱癌細(xì)胞株、尿路上皮細(xì)胞株MTDH與E-cadherin蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與癌旁組織比較，癌組織MTDH的蛋白表達(dá)水平明顯增高, E-cadherin的表達(dá)水平明顯降低。MTDH、E-cadherin表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小

5、、數(shù)量無關(guān)，與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級有關(guān)。MTDH與E-cadherin的蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.722, P<0.05）。
　　2.膀胱癌細(xì)胞株5637、T24中MTDH mRNA表達(dá)水平相對于人尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1中顯著升高；E-cadherin mRNA表達(dá)水平在膀胱癌細(xì)胞株5637、T24中相對于人尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1中顯著降低。
　　3.膀胱癌細(xì)胞株5637、T24中MTDH蛋

6、白表達(dá)水平相對于人尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1中顯著升高；E-cadherin的蛋白表達(dá)水平在膀胱癌細(xì)胞株5637、T24中相對于其在人尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1中顯著降低。
　　結(jié)論：
　　MTDH在膀胱癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，E-cadherin在癌旁組織及正常細(xì)胞中高表達(dá)。MTDH與腫瘤臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)，可作為判斷腫瘤臨床病理的分子指標(biāo)。MTDH與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，相互之間存在負(fù)向調(diào)控。
　

7、　第二部分 MTDH基因沉默對膀胱癌細(xì)胞功能學(xué)影響及其機制研究
　　目的：
　　探討抑制MTDH表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及MTDH沉默對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的影響
　　方法：
　　1. Real-time PCR檢測siRNA-MTDH轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞后MTDH mRNA變化情況，Western blot方法檢測siRNA-MTDH轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞后，MTDH蛋白表達(dá)情況，分

8、析siRNA的抑制效率，最終篩選出沉默效率最高的siRNA。
　　2.通過CCK8法檢測MTDH基因沉默后5637和 T24的增殖能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測MTDH基因沉默對5637和T24細(xì)胞凋亡的影響，細(xì)胞劃痕實驗檢測MTDH基因沉默對5637、T24細(xì)胞遷移能力的影響， Transwell實驗檢測MTDH基因沉默對5637、T24細(xì)胞的侵襲能力的影響。
　　3. Real-time PCR方法檢測siRNA2-MTDH

9、轉(zhuǎn)染5637、T24細(xì)胞后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的表達(dá)變化。Western blot檢測siRNA2-MTDH轉(zhuǎn)染5637、T24細(xì)胞后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)變化。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測siRNA2-MTDH轉(zhuǎn)染5637、T24細(xì)胞后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、V

10、imentin熒光表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.從基因及蛋白水平驗證siRNA2-MTDH沉默效率大于70％，篩選確定siRNA2用于后續(xù)實驗。
　　2. CCK8法實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，MTDH基因沉默后膀胱癌細(xì)胞5637、T24的增殖能力明顯降低，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示MTDH基因沉默后5637、T24凋亡率較對照組明顯增加，細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果提示MTDH基因沉默后5637、T24細(xì)胞

11、遷移及侵襲能力顯著降低。
　　3. Real-time PCR、Western blot實驗提示siRNA2-MTDH轉(zhuǎn)染5637、T24細(xì)胞后上皮相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測提示siRNA2-MTDH轉(zhuǎn)染5637、T24細(xì)胞后相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin熒光表達(dá)增強，陽性細(xì)胞數(shù)增多；而N-cadh

12、erin、Vimentin熒光表達(dá)減弱，陽性細(xì)胞數(shù)減少。
　　結(jié)論：
　　MTDH基因沉默抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制膀胱癌細(xì)胞遷移及侵襲，促進(jìn)上皮標(biāo)志物表達(dá)，抑制間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　第三部分 MTDH過表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞功能學(xué)影響及其機制研究
　　目的：
　　探討MTDH過表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及MTDH過表達(dá)對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的影響
　　方法：

13、
　　1.構(gòu)建MTDH過表達(dá)慢病毒載體GV341-MTDH及GV341-NC，制備慢病毒濃縮液LV-MTDH，LV-NC，感染5637、T24細(xì)胞，建立過表達(dá)MTDH的LV-MTDH單克隆細(xì)胞株及陰性對照組LV-NC細(xì)胞株。Real-time PCR檢測5637和T24細(xì)胞過表達(dá)MTDH后MTDH mRNA變化情況，Western blot方法檢測5637和T24細(xì)胞過表達(dá)MTDH后，MTDH蛋白表達(dá)情況。
　　2.通過CC

14、K8法檢測5637和 T24細(xì)胞MTDH過表達(dá)后增殖能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測MTDH基因過表達(dá)對5637和 T24細(xì)胞凋亡的影響，細(xì)胞劃痕實驗檢測MTDH基因過表達(dá)對5637、T24細(xì)胞遷移能力的影響， Transwell實驗檢測MTDH基因過表達(dá)對5637、T24細(xì)胞的侵襲能力的影響。
　　3. Real-time PCR方法檢測5637、T24細(xì)胞MTDH過表達(dá)后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadheri

15、n、Vimentin mRNA的表達(dá)變化。Western blot檢測5637、T24細(xì)胞MTDH過表達(dá)后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)變化。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測5637、T24細(xì)胞MTDH過表達(dá)后E-cadherin、N-cadherin、Vimentin熒光表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. MTDH過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功，從基因及蛋白水平證實成功建立過表達(dá)MT

16、DH的LV-MTDH單克隆細(xì)胞株及陰性對照組LV-NC細(xì)胞株。
　　2. CCK8法實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，MTDH過表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞5637、T24的增殖能力明顯增強，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示MTDH過表達(dá)后5637、T24凋亡率較對照組明顯降低，細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果提示MTDH基因過表達(dá)后5637、T24細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著增強。
　　3. Real-time PCR、Western blot實驗

17、提示5637、T24細(xì)胞MTDH基因過表達(dá)后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱，而N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)顯著增強。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測提示5637、T24細(xì)胞MTDH基因過表達(dá)后E-cadherin熒光表達(dá)減弱，陽性細(xì)胞數(shù)減少；而N-cadherin、Vimentin熒光表達(dá)增強，陽性細(xì)胞數(shù)增多。
　　結(jié)論：
　　MTDH基因過表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖，抑

18、制其凋亡，增強膀胱癌細(xì)胞遷移及侵襲能力，抑制上皮標(biāo)志物表達(dá)，提高間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　第四部分 MTDH過表達(dá)對T24、5637細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因的調(diào)控
　　目的：
　　探討MTDH過表達(dá)對T24、5637細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因的調(diào)控
　　方法：
　　1.Western blot檢測 MTDH過表達(dá)對5637、T24細(xì)胞 Wn

19、t/β-catenin信號通路、下游靶基因及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9蛋白表達(dá)的影響
　　2.免疫熒光檢測MTDH過表達(dá)5637和T24細(xì)胞對β-catenin熒光表達(dá)的影響
　　結(jié)果：
　　1.Western blot實驗提示5637、T24細(xì)胞MTDH基因過表達(dá)后Wnt通路被激活，細(xì)胞內(nèi)β-catenin總蛋白表達(dá)增多，胞核β-catenin蛋白表達(dá)顯著增多，而胞質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)明顯減低，c-Myc及MMP