絲裂霉素聯(lián)合尼美舒利對膀胱癌EJ細(xì)胞的影響及其機制研究.pdf

1、膀胱癌是最常見的泌尿系腫瘤,單純手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率較高,腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防是目前研究重點,聯(lián)合應(yīng)用不同作用機制的藥物取得了較好的效果,目前國內(nèi)外針對尼美舒利聯(lián)合絲裂霉素作用于膀胱癌的研究較少。
　　 目的:
　　 研究環(huán)氧化酶-2(Cox-2)選擇性抑制劑尼美舒利(NIM)與絲裂霉素(MMC)聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞增殖,凋亡及細(xì)胞周期的影響,研究凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2兩種蛋白在EJ細(xì)胞上的表達(dá)情況。<

2、br>　　 方法:
　　 1細(xì)胞選用人膀胱癌EJ細(xì)胞,作用培養(yǎng)時間分別為24 h、48 h、72 h。
　　 2實驗分組:采用隨機對照原則分對照組和實驗組,對照組即不做處理的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照,實驗組按實驗藥物不同分3組:MMC組:濃度為2mg／L；NIM組:濃度300 umol／L；聯(lián)合組:MMC(2mg／L)+NIM(300 umol／L)。
　　 3對照組和實驗組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,MTT

3、檢測細(xì)胞增殖抑制情況。
　　 4對照組和實驗組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,通過流式細(xì)胞儀(FCM)用AnnexinV-EGFP檢測細(xì)胞凋亡,用PI染色檢測細(xì)胞周期。
　　 5對照組和實驗組培養(yǎng)48 h,用S-P免疫組織化學(xué)染色法觀察人膀胱癌細(xì)胞株中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 6實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計,P<0.05

4、有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法測定處理后EJ細(xì)胞增殖的抑制情況
　　 在藥物作用24h、48h、72h后,不同培養(yǎng)時間的平均細(xì)胞數(shù)減少,實驗組即MMC組、NIM組、聯(lián)合組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在相同的作用因素下,作用72h后分別與24h、48h比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在相同作用時間內(nèi),聯(lián)合組與兩個單藥組之間比較,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明

5、藥物處理對細(xì)胞能產(chǎn)生一定的抑制效應(yīng),并且隨時間延長,實驗組活細(xì)胞的數(shù)量減少,以處理72h后聯(lián)合組的活細(xì)胞數(shù)量減少最明顯。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測EJ細(xì)胞的結(jié)果:
　　 2.1 EJ細(xì)胞凋亡率:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組僅MMC組、聯(lián)合組與對照組之間的細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),NIM組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在相同處理因素作用下,隨時間

6、延長,MMC組和聯(lián)合組凋亡細(xì)胞百分率均有所增加,但這兩個組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),NIM組凋亡細(xì)胞百分率隨時間延長無明顯變化(P>0.05)。
　　 2.2 EJ細(xì)胞死亡率:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組與對照組之間的細(xì)胞死亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在相同處理因素作用下,隨時間延長,實驗組各組間死亡細(xì)胞百分率均有所增加,以處理72h后聯(lián)合組細(xì)胞死亡數(shù)量最多,有統(tǒng)

7、計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期分布:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組僅NIM組、聯(lián)合組與對照組之間的G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),MMC組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在相同處理因素作用下,隨時間逐漸延長,NIM組和聯(lián)合組將細(xì)胞阻斷于G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有所增加,但這兩個組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說

8、明NIM可影響細(xì)胞周期并阻斷膀胱癌EJ細(xì)胞于G1期。
　　 4.免疫組化法觀察處理48h后細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況:
　　 免疫組化結(jié)果顯示,MMC組、NIM組、聯(lián)合組中Bax蛋白的表達(dá)有所增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組與MMC組,NIM組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩個單藥組Bax蛋白表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MMC組、NIM組、聯(lián)合組中Bcl-2蛋

9、白的表達(dá)均降低,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與MMC組,NIM組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義。兩個單藥組Bcl-2蛋白表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合組Bcl-2蛋白的表達(dá)呈陰性。
　　 結(jié)論:
　　 絲裂霉素聯(lián)合尼美舒利對于抑制體外培養(yǎng)的膀胱癌EJ細(xì)胞增殖有協(xié)同作用；
　　 Cox-2抑制劑尼美舒利可增強EJ細(xì)胞對絲裂霉素的敏感性,其機制可能與尼美舒利與細(xì)胞周期阻滯于G1期有關(guān)；