hTERT-ZEB1通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在人類腫瘤中，腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移性潛力與高端粒酶的表達(dá)密切相關(guān)。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可以通過誘導(dǎo)端粒酶的活化增強(qiáng)端粒的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡變。以往的研究表明，端粒酶可以促進(jìn)胃癌、肝癌以及食道癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。作為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的基本前提，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著非常關(guān)鍵的作用。在多種腫瘤當(dāng)中hTERT可以通過Wnt信號促進(jìn)EMT的發(fā)生，但是hTERT是否可以通過其它途徑促進(jìn)腫瘤EMT的

2、發(fā)生，至今沒有相關(guān)報(bào)道。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，hTERT可以和鋅指E-box結(jié)合同源盒1(ZEB1)形成復(fù)合物直接綁定到E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的啟動(dòng)子，從而抑制E-cadherin的表達(dá)并促進(jìn)EMT的發(fā)生。在HCT116和SW480細(xì)胞中過表達(dá)hTERT可以抑制E-cadherin的表達(dá)，但是干擾了ZEB1后即使過表達(dá)了hTERT基因，E-cadherin的表達(dá)仍然可以恢復(fù)?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明hTERT可

3、以通過在ZEB1途徑促進(jìn)EMT的發(fā)生，以hTERT、ZEB1為靶點(diǎn)的治療可以為預(yù)防、治療腫瘤的轉(zhuǎn)移提供新的途徑。
　　方法:
　　第一部分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶通過非Wnt信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌上皮間葉轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　1、采用Real-time PCR、免疫熒光及Western-blot技術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞過表達(dá)hTERT的情況，以及過表達(dá)hTERT后結(jié)腸癌細(xì)胞的形態(tài)及E-cadherin、N-cadherin等相關(guān)標(biāo)志物的

4、變化，以檢測hTERT對結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的影響;
　　2、采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測在結(jié)腸癌細(xì)胞中hTERT的過表達(dá)對E-cadherin啟動(dòng)子的影響;
　　3、Top-Fop實(shí)驗(yàn)檢測在SW480、HCT116過表達(dá)hTERT及加入Wnt抑制劑XAV后Wnt信號通路的活性，同時(shí)Western-blot及免疫熒光檢測E-cadherin的變化。以檢測hTERT及XAV對SW480、HCT116細(xì)胞Wnt信號通路的影響;
　　

5、4、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測hTERT、XAV對SW480、HCT116細(xì)胞E-cadherin啟動(dòng)子活性的影響;
　　5、Western-bolt技術(shù)分別在SW480、HCT116細(xì)胞中檢測hTERT對β-catenin入核情況的影響，用來檢測hTERT是否會(huì)通過促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核而影響Wnt信號通路的活性。
　　第二部分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶通過ZEB1促進(jìn)結(jié)腸癌上皮間葉轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究
　　1、免疫共沉淀技

6、術(shù)和激光共聚焦技術(shù)檢測hTERT、ZEB1的結(jié)合及在細(xì)胞中的定位，證實(shí)hTERT/ZEB1蛋白復(fù)合體的存在;
　　2、通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測hTERT與E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合情況及結(jié)合位點(diǎn);
　　3、通過Western-bolt技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測過表達(dá)hTERT同時(shí)干擾掉ZEB1后E-cadherin、N-cadherin等蛋白的表達(dá)，以證實(shí)hTERT是否會(huì)通過ZEB1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生;
　

7、　4、通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測hTERT是否是通過ZEB1與E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合。
　　5、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell及裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)證實(shí)從體內(nèi)、體外兩方面證實(shí)hTERT是否可以通過ZEB1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果:
　　第一部分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶通過非Wnt信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌上皮間葉轉(zhuǎn)化的研究
　　1、在SW480和HCT116細(xì)胞中hTERT可以促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上發(fā)生上皮間葉的改

8、變;
　　2、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hTERT可以顯著降低E-cadherin蛋白的表達(dá)，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著升高;
　　3、qPCR分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hTERT后間質(zhì)標(biāo)志物Snai1在SW480細(xì)胞中表達(dá)升高，而HCT116細(xì)胞并沒有變化;
　　4、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在SW480、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中hTERT可以抑制E-cadherin啟動(dòng)子的活性;
　

9、　5、Top-Fop實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SW480細(xì)胞中hTERT可以活化Wnt信號通路，但是在HCT116細(xì)胞中Wnt信號通路的活性并沒有改變;
　　6、我們用Wnt信號通路抑制劑XAV處理SW480和HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)XAV可以抑制SW480細(xì)胞的Wnt信號通路活性，E-cadherin蛋白表達(dá)也有所恢復(fù)，而HCT116細(xì)胞的Wnt信號通路活性及E-cadherin的表達(dá)并無改變;
　　7、我們在SW480和HCT116細(xì)胞中

10、抑制了Wnt信號通路的關(guān)鍵因子β-catenin，結(jié)果同樣顯示SW480細(xì)胞的Wnt信號通路被抑制，E-cadherin表達(dá)升高，HCT116細(xì)胞Wnt信號通路及E-cadherin沒有改變;
　　8、Western blot檢測SW480、HCT116細(xì)胞過表達(dá)hTERT后β-catenin的入核情況，發(fā)現(xiàn)hTERT可以促進(jìn)SW480細(xì)胞的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，而HCT116細(xì)胞核的β-catenin沒有改變;
　

11、　9、我們在SW480和HCT116細(xì)胞中抑制Wnt信號通路后，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SW480細(xì)胞中E-cadherin啟動(dòng)子活性可以恢復(fù)，而HCT116細(xì)胞E-cadherin的啟動(dòng)子活性無變化。
　　第二部分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶通過ZEB1促進(jìn)結(jié)腸癌上皮間葉轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究
　　1、免疫共沉淀證實(shí)了在HCT116細(xì)胞中hTERT可以與ZEB1相互作用。結(jié)果顯示我們在hTERT中可以拉出ZEB1，同樣的在ZEB1中我們也可

12、以拉出hTERT。激光共聚顯微鏡也觀察到了hTERT和ZEB1在HCT116細(xì)胞中的共定位;
　　2、針對ZEB1與E-cadherin啟動(dòng)子E-box區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)我們設(shè)計(jì)了3條引物，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hTERT可以和E-cadhernin啟動(dòng)子-1959bp to-1954bp區(qū)域結(jié)合;
　　3、免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)我們干擾了ZEB1后同時(shí)過表達(dá)hTERT后EMT發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。過表達(dá)hTERT后E-cadhe

13、rin表達(dá)下降，N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)。但是干擾掉ZEB1后E-cadherin恢復(fù)性調(diào)高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào);
　　4、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)hTERT后再干擾ZEB1，E-caderin啟動(dòng)子活性有所回復(fù);
　　5、染色免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hTERT后，hTERT與E-cadherin啟動(dòng)子的結(jié)合增加，但是當(dāng)我們干擾了ZEB1后hTER

14、T與E-cadherin的啟動(dòng)子結(jié)合降低;
　　6、免疫印跡檢測到到在SW480細(xì)胞里過表達(dá)hTERT后ZEB1的表達(dá)上調(diào)，但是在HCT116細(xì)胞里并沒有發(fā)現(xiàn)ZEB1的變化;
　　7、Transwell穿膜和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)hTERT后細(xì)胞的遷移能力明顯提高(p＜0.01)，但是干擾了ZEB1后細(xì)胞的遷移能力顯著下調(diào)。裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hTERT可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，但是干擾了ZEB1后腫

15、瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究首次證實(shí)了hTERT可以通過EMT促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。我們也發(fā)現(xiàn)了hTERT通過新的路徑促進(jìn)腫瘤EMT的發(fā)生。在這個(gè)研究中我們發(fā)現(xiàn)hTERT可以抑制 E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)又促進(jìn)了N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)hTERT可以抑制E-cadherin啟動(dòng)子的活性來誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，而在HCT116細(xì)胞中這條通路是獨(dú)立于Wnt信號通路的

16、，盡管在其它腫瘤中hTERT是通過Wnt這條經(jīng)典信號通路來促進(jìn)EMT的發(fā)生的。這個(gè)結(jié)果為hTERT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制補(bǔ)充了新的理論;
　　2、在這個(gè)研究的基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)了hTERT可以通過EMT促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。其機(jī)制就是hTERT可以與ZEB1相互作用形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，然后與E-cadherin的啟動(dòng)子結(jié)合抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。綜上所述我們首次證明了hTERT/ZEB1蛋白復(fù)合體的存在并結(jié)合