PKM2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附及炎癥因子分泌的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）作為消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例超過(guò)120萬(wàn)，并且每年約有60萬(wàn)人死于CRC。手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤是治療結(jié)直腸癌的首選方式，但手術(shù)后因感染誘發(fā)的炎癥反應(yīng)及腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致 CRC患者預(yù)后較差的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多基因參與的過(guò)程，包括細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附降低、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力增強(qiáng)、基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)等。其中，細(xì)胞遷移和粘附是腫瘤遷移能力的

2、重要指標(biāo)。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作為革蘭氏陰性菌外膜上的一種糖蛋白，可引起全身炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重?cái)⊙Y，與CRC術(shù)后腹內(nèi)感染并發(fā)癥有關(guān)。結(jié)直腸癌患者手術(shù)后，LPS含量會(huì)明顯上升并引起炎癥反應(yīng)。然而LPS在CRC進(jìn)程中的明確作用目前仍不清楚。因此，研究CRC粘附、轉(zhuǎn)移及炎癥微環(huán)境改變誘導(dǎo)CRC惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理，對(duì)減少CRC患者的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。
　　無(wú)論氧氣存在與否，腫瘤細(xì)胞主要依賴(lài)糖酵解

3、而不是氧化磷酸化進(jìn)行葡萄糖代謝，這一糖代謝異?，F(xiàn)象稱(chēng)為Warburg效應(yīng)。目前認(rèn)為，M2型丙酮酸激酶在Warburg效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）作為糖酵解途徑的限速酶，能夠?qū)⒘姿嵯┐际奖徂D(zhuǎn)變成丙酮酸。PKM1和PKM2作為PK最為常見(jiàn)的兩個(gè)亞型，由PKM基因經(jīng)選擇性剪接產(chǎn)生。PKM1蛋白主要在除了肝、腎和血紅細(xì)胞之外的正常細(xì)胞中高表達(dá)，而 PKM2蛋白則在干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。PKM

4、1具有穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，不受別構(gòu)調(diào)節(jié)。PKM2受到別構(gòu)調(diào)控，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生二聚體和四聚體間轉(zhuǎn)化。PKM2四聚體具有較高的丙酮酸激酶活性，而二聚體形式則具有蛋白激酶活性，兩種活性的轉(zhuǎn)換為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和對(duì)微環(huán)境的適應(yīng)能力。已有報(bào)道顯示，PKM2在腫瘤細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成和細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。然而，PKM1和 PKM2在結(jié)腸癌細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移及炎癥微環(huán)境的作用仍不明確。
　　本文通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM的DLD

5、1細(xì)胞株以及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PKM1、PKM2及PKM2不同活性突變體的DLD1細(xì)胞株，分別探討了PKM1與PKM2在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與粘附、炎癥因子分泌與增殖調(diào)控中的作用與機(jī)制；通過(guò)原核表達(dá)GST-PKM1、GST-PKM2融合蛋白來(lái)模擬分泌型PKM1和PKM2，檢測(cè)其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響并探討其作用機(jī)制。獲得以下研究結(jié)果：
　　1.通過(guò)構(gòu)建敲低PKM、過(guò)表達(dá)PKM1、PKM2以及過(guò)表達(dá)PKM2的K367M、R399E和K433E

6、等突變體的慢病毒表達(dá)載體。采用慢病毒包裝、收獲、轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選、qPCR和western blot技術(shù)檢測(cè)，得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　2.通過(guò)細(xì)胞劃痕法和細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PKM2，而不是PKM1，能夠明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及粘附。qPCR和western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PKM2能明顯提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表達(dá)，促進(jìn)FAK的磷酸化以及

7、β1-integrin的活化，并抑制E-cadherin的表達(dá)。敲低PKM能明顯逆轉(zhuǎn)PKM2誘導(dǎo)的遷移粘附相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。特別是過(guò)表達(dá)PKM2能夠上調(diào)STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核轉(zhuǎn)位。放線(xiàn)菌素D實(shí)驗(yàn)顯示，PKM2上調(diào)STAT3的表達(dá)主要是通過(guò)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，而不是通過(guò)抑制mRNA降解。在過(guò)表達(dá)PKM2的細(xì)胞株中瞬時(shí)敲低 STAT3的表達(dá)，結(jié)果表明，敲低 STAT3能夠有效逆轉(zhuǎn) PKM2誘導(dǎo)的遷移粘

8、附相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)及細(xì)胞遷移。通過(guò)檢測(cè) PKM2不同活性點(diǎn)突變的穩(wěn)定細(xì)胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表達(dá)和磷酸化水平以及細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn) DLD1-R399E細(xì)胞缺乏丙酮酸激酶活性，能明顯增加 STAT3和磷酸化 STAT3的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。
　　3. LPS可以明顯促進(jìn)DLD1細(xì)胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表達(dá)，并具有濃度依賴(lài)性，而PKM1的表達(dá)不受LPS影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS可以促進(jìn)DLD1細(xì)胞增殖。

9、Western blot、qPCR、ELISA以及MTT結(jié)果顯示，敲低PKM能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β的表達(dá)、分泌以及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。過(guò)表達(dá)PKM2可以明顯促進(jìn)TNF-α、IL-1β的表達(dá)以及LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。NF-κB的抑制劑BAY-11-7082能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB亞基p65、PKM2的表達(dá)。敲低PKM能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的STAT3的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，而對(duì)LPS誘導(dǎo)的p65的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位無(wú)影響。

10、在過(guò)表達(dá)PKM2細(xì)胞中瞬時(shí)敲低STAT3，可以逆轉(zhuǎn)由PKM2引起的TNF-α和IL-1β的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示，LPS能促進(jìn)PKM2與STAT3啟動(dòng)子的結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)STAT3的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控 TNF-α、IL-1β的表達(dá)。DLD1-R399E細(xì)胞能明顯促進(jìn) STAT3的表達(dá)和TNF-α、IL-1β的分泌。
　　4.通過(guò)原核表達(dá)純化 GST-PKM1、GST-PKM2處理 DLD1細(xì)胞模擬分泌型PKM1、PKM2的功能，發(fā)現(xiàn)

11、分泌型PKM2能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。敲低PKM2能明顯減少PKM2的分泌及由分泌型PKM2誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。分泌型PKM2能促進(jìn) MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β-catenin的表達(dá)，抑制 E-cadherin的表達(dá)。分泌型PKM2能夠促進(jìn)Akt的磷酸化，而PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002能抑制分泌型PKM2誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表達(dá)。采

12、用 siRNA干擾β-catenin表達(dá)，可以明顯逆轉(zhuǎn)分泌型 PKM2誘導(dǎo)的 E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)。
　　綜上所述：PKM2依賴(lài)其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性，調(diào)控STAT3轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和粘附。LPS通過(guò)誘導(dǎo)PKM2表達(dá)、增強(qiáng)PKM2與STAT3基因啟動(dòng)子結(jié)合、加強(qiáng)STAT3的表達(dá)與核轉(zhuǎn)位，調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞TNF-α和IL-1β的表達(dá)與分泌。分泌型PKM2能通過(guò)PI3K/Akt和β-cat