HCVc蛋白誘導膽管癌細胞上皮-間葉樣表型轉化及其分子機制的初步探討.pdf

1、近年來，國內外大量流行病學和實驗室研究發(fā)現，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染與膽管癌發(fā)生關系密切。HCV核心區(qū)基因編碼的核心蛋白(hepatitis C viruscore protein，HCVc)，在細胞的信號轉導、蛋白的相互作用、致癌及脂質代謝中起著重要作用，它可以通過激活NF-KB信號通路參與膽管癌的發(fā)生。上皮一間葉樣表型轉化(epithelial-mesenchymal transition，EM

2、T)是上皮細胞來源的惡性腫瘤的重要生物學現象，其實質是上皮細胞獲得了成纖維細胞樣表型，特征是細胞標志物改變和細胞內骨架重排，結果是細胞間粘附減弱、細胞運動能力大大增強。鑒于NF-kB信號通路在誘導EMT過程中的重要作用以及EMT可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，我們研究了HCVc蛋白與膽管癌細胞EMT的關聯性，旨在證明HCVc蛋白可以誘導膽管癌EMT發(fā)生從而促進其侵襲和轉移的可能性。賴氨酰氧化酶樣2基因(lysyl oxidase-like

3、2enzyme gene，LOXL2)是EMT的關鍵因子之一，由于其在膽管癌組織中存在著較高表達，并與膽管癌組織的分化、侵襲和轉移密切相關，我們同時探討了LOXL2在HCVc蛋白誘導膽管癌細胞EMT中的作用，旨在初步闡明膽管癌EMT的發(fā)生機理。 為了檢驗我們的假想，本實驗設計如下：首先，在膽管癌組織標本上，采用免疫組織化學的方法檢測了HCVc蛋白、上皮性標志物(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)、間葉

4、性標志物(N-cadherin、vimentin、fibronectin)在膽管癌癌組織中的表達，并評價其臨床意義；然后，轉染含有HCVc全長基因序列的重組質粒載體到膽管癌細胞QBC939中，觀察轉染后細胞形態(tài)的變化，并檢測細胞上皮性標志物、間葉性標志物及LOXL2的表達情況；最后，通過共轉染HCVc基因和LOXL2 shRNA基因到QBC939中，檢測轉染后細胞上皮性標志物、間葉性標志物的表達變化情況，以評價LOXL2在HCVc蛋白誘

5、導膽管癌細胞EMT中的作用。 結果： 1.34例膽管癌組織中HCVc蛋白的陽性表達率是47.1％，上皮性標志物的缺失率分別是E-cadherin55.9％，a-catenin70.6％，β-catenin55.9％，間葉性標志物的陽性表達率分別是N-cadherin50％，vimentin44.1％，fibronectin55.9％，HCVc蛋白的陽性表達與E-cadherin和α-catenin的缺失及N-cadher

6、in、vimentin和fibronectin的陽性表達相關(P值均<0.05)，并與膽管癌組織的淋巴結及其它臟器轉移具有相關性(P值均<0.05)。這些結果提示，HCVc蛋白可能通過誘導膽管癌組織上皮-間葉樣表型轉化的發(fā)生，促進了膽管癌的侵襲和轉移。 2.經過基因測序鑒定，PGST-HCVc195含有HCVc全長基因序列，質粒轉染靶細胞后，RT-PCR及real-time PCR檢測到HCVc mRNA的表達，免疫細胞化學和W

7、esternblotting檢測到HCVc蛋白的表達。結果表明，HCVc基因成功地轉染到膽管癌細胞QBC939中，目的基因得到高表達。 3.重組質粒轉染細胞5天后，空載體對照組細胞維持母細胞的上皮樣表型，而表達HCVc基因的實驗組細胞轉化為梭形，變得離散；通過RT-PCR、real-time PCR、免疫細胞化學和Western blotting等方法進一步檢測轉染HCVc基因后膽管癌細胞標志物的表達變化，發(fā)現上皮性標志物E-c

8、adherin在實驗組細胞中的表達水平顯著低于對照組細胞，同時間葉性標志物Vimentin、Fibronectin在實驗組細胞中的表達明顯高于對照組，這進一步提示，HCVc蛋白誘導膽管癌細胞發(fā)生了上皮-間葉樣表型轉化。 4.細胞運動和侵襲實驗結果顯示，轉染HCVc基因的實驗組細胞運動和侵襲能力顯著強于空載體對照組細胞，這提示，HCVc蛋白誘導膽管癌細胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化后，提高了細胞的運動和侵襲能力。 5.轉染PG

9、ST-HCVc195重組質粒及PGEX-3ks空載體的實驗組和對照組QBC939細胞48小時后，通過real-time PCR和Western blotting的方法檢測LOXL2基因和蛋白的表達，結果顯示：轉染HCVc基因的實驗組細胞LOXL2基因和蛋白的表達水平明顯高于空載體對照組細胞，說明HCVc基因可能上調了LOXL2基因轉錄，增加了其蛋白的表達。 6.經過酶切和基因測序鑒定，證明LOXL2 shRNA基因正確插入到所構

10、建的重組質粒載體中，在其與HCVc基因共轉染靶細胞后，熒光顯微鏡下實驗組及對照組均可見綠色熒光蛋白的表達，通過real-time PCR和Western blotting的方法檢測，發(fā)現兩組細胞均有HCVc mRNA和蛋白的表達，同時，通過real-time PCR、免疫細胞化學和Western blotting的方法也檢測到LOXL2 mRNA及蛋白的表達實驗組明顯低于空載體對照組，這說明，HCVc及LOXL2 shRNA基因成功地轉

11、染膽管癌細胞QBC939，目的基因得到較好的表達或沉默。 7.重組質粒共轉染細胞48小時后，通過real-time PCR和Western blotting的方法檢測轉染HCVc和LOXL2 shRNA基因后，膽管癌細胞標志物的表達變化，發(fā)現上皮標志物性E-cadherin在實驗組細胞中的表達水平顯著高于對照組細胞，而間葉性標志物Vimentin、Fibronectin在實驗組細胞中的表達明顯低于對照組，結果提示，LOXL2在H

12、CVc蛋白誘導膽管癌細胞發(fā)生上皮一間葉樣表型轉化中發(fā)揮了重要作用。 結論： 1.HCVc蛋白可以誘導膽管癌細胞發(fā)生上皮一間葉樣表型轉化，其特征是膽管癌細胞形態(tài)由圓形、橢圓形、多角形，排列緊密，轉化為梭形，離散；E-cadherin等上皮性標志物表達下調，Vimentin、Fibronectin等間葉性標志物表達增強，而且發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化后，膽管癌細胞的運動和侵襲轉移能力顯著提高。 2.LOXL2在HCVc