腦細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合bFGF發(fā)揮對帕金森模型動物的神經(jīng)保護作用.pdf

1、研究目的:帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，因具有進行性、多發(fā)性和起病隱匿等特點仍無法根治。紋狀體-黑質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂是產(chǎn)生帕金森運動癥狀的主要原因之一。近年來，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)被廣泛研究作為一個治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的潛在的藥物，其對帕金森病具有良好的治療效果。然而，bFGF的臨床使用效果受限于其短半衰期，高血流清除率及低生物穩(wěn)定性等。作為生物天然材料，由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix

2、，ECM)構(gòu)成的生物支架廣泛用于多種組織和器官的構(gòu)建，包括臨床前動物模型和臨床應(yīng)用。為開發(fā)以ECM為基礎(chǔ)的生物支架的新型使用方式，將ECM作為bFGF載體，利用ECM成分與生長因子的相容性，增加bFGF的穩(wěn)定性，以促進bFGF對帕金森疾病的神經(jīng)保護作用。本研究通過化學(xué)萃取法制備無細(xì)胞核殘留、細(xì)胞外基質(zhì)成分高、生物相容性好的腦去細(xì)胞外基質(zhì)，將其與bFGF共孵育，并將包含有bFGF的腦去細(xì)胞基質(zhì)分別作用于6-羥基多巴胺(6-OHDA)作用的

3、PC12細(xì)胞以及帕金森模型大鼠，觀察腦去細(xì)胞基質(zhì)對bFGF生物活性的影響，并分析其對體內(nèi)外帕金森模型的藥理作用、制劑療效及可能涉及的機制通路。
　　方法:(1)應(yīng)用化學(xué)萃取法制備腦細(xì)胞外基質(zhì)，并進行相關(guān)的質(zhì)量評價。通過掃描電鏡觀察腦去細(xì)胞外基質(zhì)(dcBECM)的微觀形態(tài)，MRI結(jié)果觀察其影像學(xué)形態(tài)，用HE染色，熒光DAPI染色、免疫組化分析其去細(xì)胞化的效果。用細(xì)胞存活率及MRI影像結(jié)果來分析腦細(xì)胞外基質(zhì)的體內(nèi)外生物相容性。

4、　　(2)制備腦細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合bFGF(bFGF+dcBECM)，Elisa法檢測bFGF體內(nèi)外釋放濃度，分析腦去細(xì)胞基質(zhì)對bFGF生物活性的影響。
　　(3)用6-OHDA損傷的PC-12細(xì)胞構(gòu)建體外帕金森病模型，并給予腦細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合bFGF進行治療。通過CCK-8實驗評價細(xì)胞存活率，評價bFGF+dcBECM對體外帕金森病模型的療效。用雄性SD大鼠經(jīng)紋狀體內(nèi)定位給予6-OHDA建立帕金森病模型，并顱內(nèi)給予bFGF+dcBEC

5、M，來評價bFGF+dcBECM對體內(nèi)帕金森病模型的療效。以阿撲嗎啡誘導(dǎo)實驗評價bFGF+dcBECM對帕金森模型大鼠的行為學(xué)改善情況;通過免疫組化染色和Western Blot考察損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)、神經(jīng)元和bFGF等的變化，考察bFGF+dcBECM經(jīng)顱內(nèi)治療對帕金森模型大鼠的療效以及相關(guān)的通路機制。
　　結(jié)果:(1)制得的腦細(xì)胞外基質(zhì)(dcBECM)外形完整，無細(xì)胞殘留，且保留了細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，如膠原蛋白，

6、纖維連接蛋白，層黏連蛋白及粘多糖等。CCK-8實驗結(jié)果顯示dcBECM不僅與PC12細(xì)胞有良好的細(xì)胞相容性，還能略微提高細(xì)胞生存率。MRI影像結(jié)果顯示dcBECM組織與大鼠腦組織具有良好的生物相容性。
　　(2) bFGF+dcBECM在體外10h后其bFGF累計釋放量達(dá)75.88％。同時，大鼠腦部經(jīng)bFGF+dcBECM顱內(nèi)治療后結(jié)果顯示，在治療后12h-3d內(nèi)，bFGF在大鼠腦內(nèi)紋狀體區(qū)表現(xiàn)為緩控釋放，并且bFGF在大鼠黑質(zhì)區(qū)

7、內(nèi)緩慢降解，延長bFGF在黑質(zhì)區(qū)的作用時間。
　　(3)帕金森病模型大鼠的行為學(xué)改善情況和損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH的增加表明dcBECM可介導(dǎo)bFGF經(jīng)顱內(nèi)入腦進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，dcBECM發(fā)揮對bFGF的緩控釋放，提高bFGF在腦內(nèi)發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元保護作用。大鼠損傷側(cè)顯著增加的bFGF、Neun和GFAP表明bFGF+dcBECM發(fā)揮對帕金森病模型大鼠的多巴胺能神經(jīng)元保護作用。同時，PErk/Erk的表達(dá)含量下降顯示bFGF+dcBE