過氧化氫誘導(dǎo)弓形蟲RH株速殖子凋亡的初步研究.pdf

1、剛地弓形蟲病是一種在全球內(nèi)普遍流行的人獸共患寄生蟲病。不僅對孕婦和胎兒構(gòu)成了極大的威脅，近年來又成為AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形蟲藥物大部分都存在長期治療效果差、難根治、高費用且對免疫功能缺陷患者基本無治療效果等諸多缺點，研發(fā)新型治療弓形蟲病藥物很有必要。藥物研究依賴于高效穩(wěn)定的弓形蟲體內(nèi)和體外培養(yǎng)模型，建立弓形蟲培養(yǎng)模型不僅可用于篩選新型抗弓形蟲藥物，還可用于抗弓形蟲藥物的作用機理研究。過氧化氫(Hydro

2、gen Peroxide，H2O2)對細胞的活力和增殖力均具有抑制和/或殺傷作用，然而有關(guān)H2O2能否誘導(dǎo)弓形蟲凋亡的作用機制仍然不清楚。近年來,不少數(shù)據(jù)表明，H2O2可以誘導(dǎo)眾多細胞凋亡，本文以H2O2是否能誘導(dǎo)弓形蟲速殖子凋亡作探討，旨在進一步闡明H2O2誘導(dǎo)弓形蟲RH株凋亡的機制，為弓形蟲病的免疫預(yù)防和臨床治療新方案的設(shè)計提供理論和實驗依據(jù)。復(fù)蘇剛地弓形蟲RH株速殖子，注射接種小鼠腹腔；建立蟲體與小鼠巨噬細胞（RAW264.7）細

3、胞的共同培養(yǎng)體系，依次以不同比例的蟲體接種細胞，觀察蟲體在細胞內(nèi)的增殖情況，確定適宜的蟲體與細胞感染比例及培養(yǎng)時間。以濾膜過濾法純化體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)模型獲得速殖子。采用吉姆薩染色、瓊脂糖凝膠電泳、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）、流式細胞技術(shù)測定 DNA含量檢測 H2O2處理弓形蟲速殖子凋亡的特征；檢測凋亡過程中胞內(nèi)鈣離子濃度變化。RH株速殖子可在RAW264.7細胞內(nèi)增殖，接種72h后細胞能完全被破壞釋放出大量蟲體，蟲體

4、在細胞內(nèi)增殖速度和傳代間隔穩(wěn)定、形態(tài)典型，未見毒力明顯減弱。兩種濾膜對體內(nèi)白細胞清除率無明顯差異，對紅細胞清除效果隨濾膜孔徑增大依次降低，小鼠體內(nèi)速殖子的回收率隨著孔徑增大依次升高。兩種濾膜對RAW264.7細胞的清除率無明顯差異,體外培養(yǎng)的速殖子的回收率隨著濾膜孔徑增大而升高，并且兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。光鏡下觀察H2O2處理弓形蟲后，蟲體失去典型形態(tài)，活力明顯下降。瓊脂糖凝膠電泳測定H2O2處理速殖子后的DNA未見片段化條帶，以流式