過氧化氫誘導弓形蟲RH株速殖子凋亡的初步研究.pdf

1、剛地弓形蟲病是一種在全球內普遍流行的人獸共患寄生蟲病。不僅對孕婦和胎兒構成了極大的威脅，近年來又成為AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形蟲藥物大部分都存在長期治療效果差、難根治、高費用且對免疫功能缺陷患者基本無治療效果等諸多缺點，研發(fā)新型治療弓形蟲病藥物很有必要。藥物研究依賴于高效穩(wěn)定的弓形蟲體內和體外培養(yǎng)模型，建立弓形蟲培養(yǎng)模型不僅可用于篩選新型抗弓形蟲藥物，還可用于抗弓形蟲藥物的作用機理研究。過氧化氫(Hydro

2、gen Peroxide，H2O2)對細胞的活力和增殖力均具有抑制和/或殺傷作用，然而有關H2O2能否誘導弓形蟲凋亡的作用機制仍然不清楚。近年來,不少數(shù)據(jù)表明，H2O2可以誘導眾多細胞凋亡，本文以H2O2是否能誘導弓形蟲速殖子凋亡作探討，旨在進一步闡明H2O2誘導弓形蟲RH株凋亡的機制，為弓形蟲病的免疫預防和臨床治療新方案的設計提供理論和實驗依據(jù)。復蘇剛地弓形蟲RH株速殖子，注射接種小鼠腹腔；建立蟲體與小鼠巨噬細胞（RAW264.7）細

3、胞的共同培養(yǎng)體系，依次以不同比例的蟲體接種細胞，觀察蟲體在細胞內的增殖情況，確定適宜的蟲體與細胞感染比例及培養(yǎng)時間。以濾膜過濾法純化體內培養(yǎng)和體外培養(yǎng)模型獲得速殖子。采用吉姆薩染色、瓊脂糖凝膠電泳、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）、流式細胞技術測定 DNA含量檢測 H2O2處理弓形蟲速殖子凋亡的特征；檢測凋亡過程中胞內鈣離子濃度變化。RH株速殖子可在RAW264.7細胞內增殖，接種72h后細胞能完全被破壞釋放出大量蟲體，蟲體

4、在細胞內增殖速度和傳代間隔穩(wěn)定、形態(tài)典型，未見毒力明顯減弱。兩種濾膜對體內白細胞清除率無明顯差異，對紅細胞清除效果隨濾膜孔徑增大依次降低，小鼠體內速殖子的回收率隨著孔徑增大依次升高。兩種濾膜對RAW264.7細胞的清除率無明顯差異,體外培養(yǎng)的速殖子的回收率隨著濾膜孔徑增大而升高，并且兩者間差異有統(tǒng)計學意義。光鏡下觀察H2O2處理弓形蟲后，蟲體失去典型形態(tài)，活力明顯下降。瓊脂糖凝膠電泳測定H2O2處理速殖子后的DNA未見片段化條帶，以流式