IFN-γ抑制弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，能夠感染包括禽類、哺乳類在內(nèi)的絕大多數(shù)溫血動物從而引起人獸共患弓形蟲病。弓形蟲感染一般不具有明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者能夠終生攜帶組織包囊而不呈現(xiàn)任何臨床癥狀。然而，對一些免疫抑制人群，例如艾滋病患者和器官移植病人，弓形蟲感染可以由慢性感染轉(zhuǎn)化為急性感染從而引起嚴重的后果。弓形蟲的這種機會致病性是由速殖子和緩殖子之間的相互轉(zhuǎn)化引起的。運輸應激能夠抑制機體免疫功能，引起

2、干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生減少，常導致一些隱性感染疾病的爆發(fā)。由于IFN-γ具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，能夠調(diào)節(jié)機體多種抗蟲效應物的合成，在動物機體抗弓形蟲急慢性感染中都發(fā)揮著重要作用，所以我們推測運輸應激可能誘發(fā)弓形蟲慢性感染的再活化，引發(fā)急性弓形蟲病，而原因很可能與IFN-γ影響弓形蟲速殖子與緩殖子的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　 本研究首先通過建立弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化的細胞模型，在體外驗證了IFN-γ對緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的抑制

3、作用;然后利用模擬運輸應激，人工誘發(fā)弓形蟲慢性感染小鼠腦組織包囊的再活化，并在相同應激條件下通過干擾素誘導劑PolyI∶C在體內(nèi)驗證了IFN-γ對緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的抑制作用，具體工作包括以下幾個方面:
　　 (1)弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)化模型的建立
　　 本研究分別利用pH8.1堿性條件和43℃高溫熱激兩種方法成功誘導弓形蟲RH株速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子。在分別誘導培養(yǎng)4天和48小時的過程中，鏡下觀察均可見類包囊樣結(jié)

4、構(gòu)的蟲體。RT-PCR在兩種誘導方法中均能檢測到緩殖子期特異基因BAG1和SAG2C的表達。利用Real-time PCR監(jiān)測兩種誘導條件下速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化的進程，結(jié)果顯示隨著誘導時間的延長，堿性誘導下BAG1基因的相對表達水平先逐漸升高然后下降，高溫誘導下BAG1基因的相對表達水平逐漸升高，表明在細胞狀態(tài)允許的情況下，速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化隨著誘導時間的延長而逐漸增加。此外，我們利用正常培養(yǎng)條件成功誘導PRU株緩殖子轉(zhuǎn)化為速殖子。PR

5、U株緩殖子經(jīng)4天的正常培養(yǎng)誘導后，鏡下可觀察到大量增殖的蟲體，半定量RT-PCR顯示SAG1的表達水平逐漸升高，而在正常培養(yǎng)1天后BAG1的表達水平就已基本檢測不到。
　　 (2) IFN-γ體外抑制緩殖子向速殖子的轉(zhuǎn)化
　　 利用緩殖子向速殖子體外轉(zhuǎn)化模型，驗證外源性IFN-γ對蟲體期轉(zhuǎn)化的影響。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，在加入IFN-γ的情況下堿性誘導的緩殖子和天然緩殖子經(jīng)正常培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)物中均可檢測到BAG1

6、基因的表達，這表明IFN-γ能在一定程度抑制緩殖子向速殖子的體外轉(zhuǎn)化。此外，IFN-γ濃度梯度實驗表明這種抑制作用與IFN-γ的濃度有關(guān)，較高濃度的IFN-γ(80～160UI/mL)能有效地抑制緩殖子向速殖子的體外轉(zhuǎn)化。
　　 (3) IFN-γ體內(nèi)抑制緩殖子向速殖子的轉(zhuǎn)化
　　 通過Real-time PCR檢測模擬運輸應激前后弓形蟲慢性感染小鼠腦組織中IFN-γ，IL-12，BAG1以及SAG1相對表達水平的變化。

7、結(jié)果顯示，未處理應激組中IFN-γ，IL-12，BAG1相對表達水平顯著下降，而SAG1的相對表達水平顯著升高，表明包囊內(nèi)的緩殖子向速殖子發(fā)生了轉(zhuǎn)化，模擬運輸應激誘發(fā)了包囊的再活化;相反的是，PolyI∶C預處理應激組中IFN-γ，IL-12的相對表達水平略有下降但差異不顯著，并且BAG1和SAG1的相對表達水平均無顯著性變化，表明干擾素誘導劑PolyI∶C通過誘導腦組織中IFN-γ的增加，從而在體內(nèi)抑制緩殖子向速殖子的轉(zhuǎn)化。