剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子在鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：弓形蟲(chóng)感染可引起多種組織器官的病變，其中危害最為嚴(yán)重的是弓形蟲(chóng)穿越血腦屏障入侵人腦引起的弓形蟲(chóng)腦炎。本實(shí)驗(yàn)建立剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子體外感染SD大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的模型，研究自噬現(xiàn)象在弓形蟲(chóng)速殖子入侵星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中的作用，為探討弓形蟲(chóng)速殖子感染腦非特異免疫細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞的可能的機(jī)制提供基礎(chǔ)。
　　 方法：1.原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)混合膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)振蕩的方法，得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)免疫組化鑒定細(xì)胞純度。

2、>　　 2.復(fù)蘇凍存的弓形蟲(chóng)速殖子，腹腔感染昆明小鼠，待到小鼠出現(xiàn)感染癥狀，抽取腹腔液，觀察弓形蟲(chóng)速殖子毒力情況，直到接種三代，收集弓形蟲(chóng)速殖子。
　　 3.待星形膠質(zhì)細(xì)胞傳到第三代時(shí)，將其接種于預(yù)先放有玻片的培養(yǎng)皿中，等到細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80％，弓形蟲(chóng)RH株速殖子與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，0.5～72h，Giemsa染色，觀察速殖子的增殖情況。
　　 4.將共培養(yǎng)的弓形蟲(chóng)速殖子與星形膠質(zhì)細(xì)胞，放在活細(xì)胞工作站下，觀察RH

3、速殖子與星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用方式。
　　 5.MDC染色，熒光顯微鏡下觀察0～48h內(nèi)，共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的變化。
　　 結(jié)果：（1）星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)恒溫振蕩分離，傳至第三代，此時(shí)細(xì)胞成熟，狀態(tài)穩(wěn)定。并經(jīng)GFAP抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定，純度為95％以上。
　　 （2）速殖子可在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種，每2～3天傳代1次。傳至第三代時(shí)，弓形蟲(chóng)速殖子毒力完好。
　　 （3）弓形蟲(chóng)速殖子與星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

4、2h，有蟲(chóng)體開(kāi)始進(jìn)入細(xì)胞；8h后進(jìn)入細(xì)胞蟲(chóng)體增多明顯；24h絕大多數(shù)蟲(chóng)體已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞；到48h，大多數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可以看到蟲(chóng)體形成的假包囊，包囊最初形成時(shí)蟲(chóng)體呈菊花狀排列，然后以二分裂的方式增殖，逐漸形成成熟的包囊，等待突破細(xì)胞膜的時(shí)；72h大部分細(xì)胞已被蟲(chóng)體漲破，大量蟲(chóng)體從細(xì)胞中釋放，開(kāi)始新的感染-假包囊-增殖-破膜的過(guò)程。經(jīng)過(guò)這一周期，蟲(chóng)體可增殖10～20倍。
　　 （4）活細(xì)胞工作站下，觀察到首先弓形蟲(chóng)速殖子以其側(cè)面與星

5、形膠質(zhì)細(xì)胞膜接觸，然后再以頂部鉆入，弓形蟲(chóng)速殖子是主動(dòng)入侵鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 （5）MDC染色，弓形蟲(chóng)速殖子與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)1h，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)點(diǎn)狀熒光顆粒；2h、4h、8h，細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒逐漸增加，以8h最為顯著；在12h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒明顯減少，伴隨細(xì)胞出現(xiàn)損傷，但形態(tài)尚完整；蟲(chóng)體感染細(xì)胞24h和48h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒幾乎消失，同時(shí)細(xì)胞被破壞。
　　 結(jié)論：建立了弓形蟲(chóng)RH速殖子體外感染鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的模