玉米赤霉烯酮對TM3細(xì)胞增殖、遷移及MicroRNA表達(dá)的影響.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種常見的具有類雌激素作用的真菌毒素。ZEA的毒性作用范圍廣泛，近年來人們發(fā)現(xiàn)ZEA可誘導(dǎo)睪丸問質(zhì)腫瘤的發(fā)生，但機(jī)制不明。所以，探究ZEA對睪丸間質(zhì)細(xì)胞作用的機(jī)制，對揭示ZEA誘導(dǎo)雄性動物睪丸間質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)生的機(jī)理具有重要意義。本試驗(yàn)以TM3細(xì)胞（小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系）為材料，研究暴露于低濃度ZEA下，TM3細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞周期及相關(guān)調(diào)控蛋白的變化;利用二代高通量測序技術(shù)，

2、篩選了差異表達(dá)的miRNAs，并利用Parhway分析和GO分析對ZEA誘導(dǎo)TM3細(xì)胞腫瘤發(fā)生的相關(guān)通路和蛋白進(jìn)行了預(yù)測;通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法對篩選的miRNA和預(yù)測的信號通路相關(guān)蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　1.ZEA對TM3細(xì)胞增殖活力及遷移的影響。
　　用不同濃度ZEA(0μmol/L、0.01μmol/L、0.02μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1 mol/L、0.5μmol/L)處理

3、TM3細(xì)胞24h，CCK-8法檢測ZEA對TM3細(xì)胞增殖活力影響;利用RTCA細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測儀，監(jiān)測不同濃度ZEA（分組同上）對TM3細(xì)胞指數(shù)的影響;用不同濃度ZEA（0μmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L）處理細(xì)胞12h，Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移的變化;RTCA監(jiān)測暴露在不同濃度ZEA（0μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L）

4、下，TM3細(xì)胞遷移率的變化;以0.01μmol/L濃度的ZEA染毒TM3細(xì)胞2h、6h、9h、18h，PI熒光染色法檢測TM3細(xì)胞周期的變化、免疫印跡法(WesternBlot)檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4，Bcl-2基因家族成員的表達(dá)情況。結(jié)果:與對照組相比，0.05μmol/L ZEA以下濃度染毒組細(xì)胞相對增殖活力極顯著升高(P＜0.01)，0.1μmol/L ZEA染毒組則顯著性升高（P＜0.05），而0

5、.5μmol/L ZEA染毒組差異不顯著（P≥0.05）;RTCA結(jié)果顯示，染毒24h(細(xì)胞生長至45h)時(shí)，各染毒組CI較對照組均升高，但升高幅度隨染毒濃度的升高呈下降趨勢，0.1μmol/L ZEA以上濃度染毒組與對照組比較CI曲線變化不明顯;Transwell結(jié)果可見，隨著ZEA濃度升高，穿過小室的細(xì)胞越多，0.03μmol/LZEA以下濃度染毒組較對照組差異顯著(P＜0.05)，其余染毒組較對照差異極顯著(P＜0.01);RTC

6、A監(jiān)測結(jié)果顯示，ZEA染毒30h后，0.01μmol/L染毒組遷移指數(shù)相比對照組逐漸升高，其余濃度組則變化不明顯;PI熒光染色法和免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，隨著染毒時(shí)間的延長，分布于G1/G0期的細(xì)胞逐漸減少，向S期和G2期轉(zhuǎn)化，而細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表達(dá)量隨著染毒時(shí)間延長而逐漸上升(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，低濃度的ZEA在一定濃度范圍內(nèi)對TM3細(xì)胞的增殖與遷移的能力具有促進(jìn)作用，選取0.01μmo

7、l/L濃度的ZEA作為測序濃度，染毒時(shí)間點(diǎn)選為2h、6h、18h。
　　2.ZEA對TM3細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響。
　　用0.01μmol/L濃度ZEA處理TM3細(xì)胞0h、2h、6h、18h，提取樣品總RNA，利用Illumina二代高通量測序平臺Hiseq2000進(jìn)行深度測序分析;利用KEEP和GO分析，預(yù)測增殖、遷移相關(guān)miRNAs的靶基因與靶蛋白。結(jié)果:對照組得到9481806個miRNA讀段數(shù)、ZEA處理2h

8、得到920676個miRNA讀段數(shù)、處理6h得到8779706個miRNA讀段數(shù)、處理18h得到9206769個miRNA的讀段數(shù)。其長度主要集中在21-24nt，正好是miRNA的典型長度。2h染毒組和正常組對比共有99個miRNA發(fā)生變化，其中上調(diào)有41個，58個下調(diào);6h和2h染毒組對比有100個miRNA表達(dá)存在差異，其中上調(diào)miRs有43個，57個下調(diào);18h和6h染毒組對比有138個miRs發(fā)生變化，其中49個miRs上調(diào)，

9、89個下調(diào);Parhway分析發(fā)現(xiàn)，富集值較高的通路共有20條，而GO分析篩選出52個差異條目，其中包含MAPK信號通路、AMPK信號通路多條重要的增殖、遷移相關(guān)的信號通路，還包括NF-kappa B炎癥反應(yīng)信號通路。結(jié)合測序結(jié)果分析，同時(shí)查閱大量文獻(xiàn)，按照增殖和遷移兩大功能分類，篩選出最可能受ZEA影響，調(diào)控TM3細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)5個miRs，及MAPK信號通路相關(guān)蛋白。
　　3.高通量測序及靶蛋白預(yù)測結(jié)果的驗(yàn)證。
　

10、　0.01μmol/L ZEA分別處理TM3細(xì)胞0h、2h、6h、18h，提取總RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測表達(dá)差異的基因Let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-10a-5p、miR-21a-5p;采用蛋白免疫印跡法，檢測MAPK信號通路中相關(guān)蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38，同時(shí)檢測內(nèi)參蛋白β-Actin。結(jié)果:樣本RNA純度合格，染毒2h組與對照比，Let-7c-5p

11、、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-10a-5p表達(dá)均下調(diào)，而miR-21a-5p表達(dá)上調(diào);隨著染毒時(shí)間增加， miR-21a-5p和miR-7a-5p表達(dá)均下調(diào)，而Let-7c-5p、miR-10b-5p和miR-10a-5p的表達(dá)均上調(diào)，與測序結(jié)果一致，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);免疫印跡結(jié)果顯示，2h無明顯變化，但是隨著染毒時(shí)間增加，JNK磷酸化水平極顯著下降(P＜0.01);而ERK和P38在2h也無明顯變化