姜黃素對(duì)多巴胺能細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，目的：探討姜黃素（Cur）對(duì)魚藤酮（Ro）致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法：用魚藤酮建立PC12細(xì)胞損傷模型；姜黃素進(jìn)行干預(yù)。用四氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力；蘇木素、伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶(SOD)的活性；DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）水平；流式細(xì)胞術(shù)（Annexin-FITC/PI雙染法）檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)

2、果：0.5μmol/L—1.0μmol/L姜黃素均可減輕0.1μmol/L魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞增殖活力的抑制；明顯減輕了細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變；明顯增加了PC12細(xì)胞內(nèi)SOD的活性；明顯降低了PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的含量、明顯抑制了魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　 結(jié)論：姜黃素可拮抗魚藤酮致PC12細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與清除細(xì)胞內(nèi)ROS,誘導(dǎo)抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 第二部分，目的：探討姜黃素(Curcumin

3、)對(duì)α-突觸核蛋白(α-synuclein)聚集的影響,及其拮抗魚藤酮(Ro)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。
　　 方法：選用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞,利用魚藤酮誘導(dǎo)其損傷建立帕金森病細(xì)胞模型,利用姜黃素進(jìn)行干預(yù);采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白酶體水解酶活性、Western blotting法檢測(cè)α-突出核蛋白表達(dá)、免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-突出核蛋白聚集、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果

4、：魚藤酮組PC12細(xì)胞活力及蛋白酶體水解酶活性明顯降低, α-突出核蛋白表達(dá)和聚集以及細(xì)胞凋亡率明顯增加;經(jīng)0.5、1.0、5.0、10μmol/L各濃度姜黃素預(yù)處理4h后與0.1μmol/L魚藤酮共同孵育PC12細(xì)胞24h, 0.5和1.0μmol/L的姜黃素使細(xì)胞活力以及蛋白酶體水解酶活性明顯升高、α-突出核蛋白的表達(dá)和聚集明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯降低；5.0和10μmol/L姜黃素對(duì)魚藤酮的拮抗作用明顯減弱，細(xì)胞活力和蛋白酶體水解

5、酶活性、以及細(xì)胞凋亡率與魚藤酮組比較均無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：低濃度姜黃素能夠通過誘導(dǎo)PC12細(xì)胞蛋白酶體水解酶活性、抑制α-突出核蛋白的表達(dá)和聚集,從而拮抗魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷。
　　 第三部分，目的：探討姜黃素（curcumin,Cur）通過誘導(dǎo)熱休克蛋白（Hsp70）高表達(dá)、抑制α-突觸核蛋白的異常表達(dá)和聚集、促進(jìn)蛋白酶體系統(tǒng)降解異常α-突觸核蛋白(α-synuclein)對(duì)多巴胺能細(xì)胞的保護(hù)作用。

6、r>　　 方法：選用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞,利用魚藤酮誘導(dǎo)其損傷建立帕金森病細(xì)胞模型,利用姜黃素進(jìn)行干預(yù);采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白酶體水解酶活性、Western blotting法檢測(cè)Hsp70和α-突出核蛋白的表達(dá)、免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Hsp70的表達(dá)和α-突出核蛋白的聚集。
　　 結(jié)果：魚藤酮組PC12細(xì)胞活力及蛋白酶體水解酶活性明顯降低, Hsp70的表達(dá)輕度增加、α-突出核蛋白表達(dá)和聚集明顯增

7、加;經(jīng)不同濃度姜黃素預(yù)處理4h后與0.1μmol/L魚藤酮共同孵育PC12細(xì)胞24h,與魚藤酮組比較，0.5μmol/L和1.0μmol/L的姜黃素使細(xì)胞活力以及蛋白酶體水解酶活性明顯升高、Hsp70表達(dá)明顯升高，α-突出核蛋白的表達(dá)和聚集明顯減少；5.0μmol/L和10μmol/L姜黃素對(duì)魚藤酮的拮抗作用明顯減弱，細(xì)胞活力與魚藤酮組比較均無(wú)明顯差異（P＜0.05)，胰蛋白酶、多肽-谷氨酰多肽水解酶活性與魚藤酮組比較均無(wú)明顯差異（P＜

8、0.05)、10μmol/L姜黃素組糜蛋白酶樣水解酶活性進(jìn)一步降低，與魚藤酮組比較有極顯著性差異（P＜0.01)。
　　 結(jié)論：低濃度姜黃素能夠通過誘導(dǎo)PC12細(xì)胞表達(dá)Hsp70、誘導(dǎo)蛋白酶體水解酶活性、進(jìn)而抑制α-突出核蛋白的表達(dá)和聚集,從而拮抗魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷。
　　 第四部分，目的：探討小膠質(zhì)細(xì)胞在多巴胺能細(xì)胞損傷中的作用，以及姜黃素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制。
　　 方法：

9、選用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞,利用魚藤酮誘導(dǎo)其損傷建立帕金森病細(xì)胞模型,用姜黃素預(yù)處理4h的BV-2細(xì)胞再經(jīng)魚藤酮處理4h后的細(xì)胞上清作為條件培養(yǎng)液（Microglia conditioned medium with Curcumin，MCMC），處理PC12細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法（MTT 法）檢測(cè)細(xì)胞活力；DCFH-DA 染色檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）水平；磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinⅤ）-碘化丙

10、啶（PI）雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。Western blotting 法檢測(cè)NADPH 氧化酶P47－phox亞基蛋白在BV-2細(xì)胞膜上的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組組相比，姜黃素預(yù)處理的BV-2細(xì)胞，其ROS水平降低（P＜0.01）；受MCMC 處理的PC12細(xì)胞，細(xì)胞活力增加，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.01）。而單獨(dú)用5nM魚藤酮作用于PC12細(xì)胞，其存活率及凋亡率與空白組相比無(wú)明顯差別（P>0.05）。魚藤酮誘導(dǎo)