STIM1抗體封閉對fMLP誘導的人中性粒細胞極性及趨化性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 中性粒細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當機體遭受外來細菌和病原體入侵時,充當?shù)谝坏婪谰€,它們的主要功能是滲出血管壁并遷移到炎癥灶,通過吞噬作用和釋放超氧化物和/或蛋白水解酶殺死細菌和入侵的微生物。這種外滲和遷移的機制是通過細胞的極性和趨化性來實現(xiàn)的。臨床上一些疾病例如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷和器官移植的排斥反應、動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、過敏反應、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都與中

2、性粒細胞極性功能的增強和減弱有關(guān)。因此深入探討中性粒細胞極性調(diào)節(jié)機制為抵抗中性粒細胞激活導致的機體組織損傷尋找到新的干預和治療靶點。
　　 鈣信號調(diào)控細胞內(nèi)許多重要生理、病理過程,胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高依賴于兩種途徑:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放和細胞膜外鈣內(nèi)流。鈣池操縱的鈣流入(store-operatedcalcium entry,SOCE)是非興奮細胞的主要鈣流入形式。近年來隨著蛋白基質(zhì)交互分子(stromal interaction

3、molecule,STIM)的發(fā)現(xiàn),將SOCE調(diào)控機制的研究向前推進了一步。Liou,Roos等證實了STIM1而非STIM2調(diào)控著SOCE。STIM1作為SOCE的關(guān)鍵分子,主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)內(nèi),也有少量分布于質(zhì)膜(plasma membrane,PM)上,它包含著一個定位于ER內(nèi)的EF-hand基序,充當著鈣離子感受器的角色。文獻報導SOCE在細胞極性及趨化過程中發(fā)揮著重要作用,但對

4、于STIM1分子在其中的作用及作用機制缺乏研究。
　　 細胞的極性機制研究中存在著依賴P13K和非依賴P13K兩條途徑。P13K-Akt被認為是經(jīng)典的極性信號通路,也有研究表明酪氨酸激酶Src、Rho小G蛋白參與極性形成、細胞的遷移、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。而對于fMLP誘導的人中性粒細胞極性及趨化過程中是否也存在這樣的信號傳導通路尚不清楚。
　　 人中性粒細胞為終末血細胞,在體外存活時間短,難于進行基因操作或RNA干擾,那

5、么電轉(zhuǎn)抗體封閉技術(shù)對于這種短時程的研究不失為一種行之有效的手段。為了闡明SOCE在人中性粒細胞極性及趨化性的作用以及調(diào)控機制,本實驗采用此技術(shù)封閉細胞內(nèi)STIM1蛋白分子,觀察其對中性粒細胞趨化率的影響,以及相關(guān)的信號蛋白分子Akt,Src,Pho小G蛋白的變化。
　　 目的：
　　 本實驗通過研究STIM1抗體封閉后對fMLP誘導的人中性粒細胞極性及趨化性的影響,探討SOCE在人中性粒細胞極性及趨化性中的作用及其調(diào)控機

6、制。
　　 方法：
　　 1.采用Dextran作用下紅細胞自然沉降,Ficoll-Hypaque密度梯度離心,低滲裂解紅細胞的方法急性分離人外周血中性粒細胞。
　　 2.使用電轉(zhuǎn)儀將anti-STIM1抗體轉(zhuǎn)入人中性粒細胞內(nèi)以進行后續(xù)的人中性粒細胞極性及趨化性的研究。
　　 3.采用Immunoprecipitation和Western blotting檢測anti-STIM1抗體電轉(zhuǎn)效果。
　　

7、 4.使用Zigmond chamber觀察STIM1抗體封閉后fMLP誘導的人中性粒細胞趨化率的變化。
　　 5.應用GST pull-down and Western blotting方法檢測STIM1抗體封閉后fMLP誘導的人中性粒細胞極性及趨化過程中相關(guān)信號分子的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Immunoprecipitation和Western blotting檢測anti-STIM1抗體電轉(zhuǎn)效率顯

8、著,電轉(zhuǎn)anti-STIM1抗體組檢測到的蛋白信號強于非電轉(zhuǎn)組(P<0.001)。
　　 2.Control組、IgG組、anti-STIM1三組間趨化率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),趨化率的大小為Control組>IgG組>anti-STIM1組。
　　 3.免疫印跡結(jié)果顯示Control組加與不加fMLP刺激p-Akt檢測到的蛋白條帶信號很弱,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.505),Src磷酸化以及Rac1,R

9、ac2,Cdc42活化水平加fMLP刺激后高于不加fMLP(P<0.001)；IgG組有著相同趨勢,p-Akt無變化(P=0.766),p-Src,GTP-Rac1,GTP-Rac2,GTP-Cdc42在fMLP刺激后其含量高于不加fMLP(P<0.001):anti-STIM1組p-Akt差異無統(tǒng)計學意義(P=0.476),p-Src(=0.315),GTP-Rac1(P=0.944),GTP-Rac2(P=0.386),GTP-Cd