脂筏在fMLP誘導的人中性粒細胞極性化過程中作用的研究.pdf

1、研究背景: 中性粒細胞（Polymorphonuclear nertrophils）是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細胞在宿主抵抗細菌和真菌感染中起著重要的作用，他們的主要功能是在機體發(fā)生炎癥時，通過外滲出血管壁并遷移到炎癥位置，通過吞噬作用和釋放超氧化物和/或蛋白水解酶殺死細菌和入侵的微生物。一旦感知到趨化物質的存在，中性粒細胞前極形成一個富含絲狀肌動蛋白的片狀偽足，后極形成富含肌球蛋白的尾足。雖然中性粒細胞在生理功能中發(fā)揮重要作

2、用，但如果遷移和外滲的機制和任何信號分子調(diào)控失敗，都會導致中性粒細胞的異常激活。臨床上一些疾病如類風濕性關節(jié)炎、哮喘、敗血癥、缺血/再灌注損傷、病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化、過敏反應、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉移都和中性粒細胞極性功能有關。因而研究中性粒細胞極性機制，對防止中性粒細胞異常激活導致的各種疾病和組織損傷具有重要意義。
　　 在極性研究的過程中，脂筏作為信號分子組織者是近些年的研究熱點。脂筏就像一個蛋白質分子停靠的平

3、臺，在受到外源趨化物的誘導下，它組裝大量的信號分子，與膜的信號轉導、蛋白質分選等保持高度密切的關系。脂筏上的膽固醇能夠被甲基-β-環(huán)糊精（mβCD）包裹，從而破壞脂筏的結構。在研究中使用mβCD包裹膽固醇后破壞脂筏結構完整性，抑制了細胞的皺褶形成，使用CLM可以可逆性修復脂筏結構的完整性，這表明脂筏在中性粒細胞極性化過程中有著很重要的作用。
　　 近年來，細胞內(nèi)游離鈣濃度（Ca2+）變化被認為參與中性粒細胞多種功能調(diào)節(jié)，如極性（

4、趨化）和遷移、活性氧的產(chǎn)生。胞質內(nèi)Ca2+濃度升高依賴于兩種途徑:內(nèi)質網(wǎng)鈣庫釋放和細胞膜外鈣內(nèi)流。胞外鈣內(nèi)流主要由內(nèi)質網(wǎng)鈣庫清空引起質膜上的鈣通道開放導致外鈣內(nèi)流，就是所謂的鈣庫操縱的鈣內(nèi)流機制(SOCE)。脂筏作為SOCE的信號平臺對于中性粒細胞極性化有著重要的作用，因而探討中性粒細胞極性化過程中膜電流的特性就顯得尤其重要，可以為研究中性粒細胞極性化提供電生理理論依據(jù)。
　　 另有研究表明Rho小G蛋白參與極性形成、細胞的遷移

5、、腫瘤的侵襲與轉移等。尤其是Rac1，Rac2通過調(diào)節(jié)細胞骨架而參與細胞極性和趨化的調(diào)節(jié)機制已經(jīng)有很多文獻報道過。Rho家族小G蛋白在中性粒細胞中參與細胞骨架重組，這些蛋白通過失活(GDP-bound)和激活(GTP-bound)兩種狀態(tài)的循環(huán)來控制一些生理過程，他們的活性是由鳥嘌呤核苷分解抑制因子(guanosine dissociationinhibitors)，GTPase活化蛋白（GTPase activating protei

6、ns）和鳥嘌呤核苷交換因子(guanosine exchange factors，GEF)來調(diào)節(jié)。
　　 因此，深入闡明脂筏在fMLP所誘導的人中性粒細胞極性化的影響過程中的作用，為防止和治療中性粒細胞異常激活提供新的方向。
　　 目的:本實驗通過研究脂筏對fMLP所誘導的人中性粒細胞極性的影響，探討脂筏在人中性粒細胞極性中的調(diào)控機制。
　　 方法:
　　 1.采用Dextran方法讓紅細胞自然沉降，運用

7、經(jīng)典密度梯度離心，低滲裂解紅細胞后急性分離人外周血中性粒細胞。獲得的中性粒細胞進行臺盼藍染色，分析細胞活性，細胞的活度大于98％。
　　 2.用Zigmond chamber觀察中性粒細胞的極性化率。
　　 3.Transwell小室實驗檢測中性粒細胞的定向遷移能力的變化。
　　 4.運用膜片鉗相關儀器檢測電極電阻并對中性粒細胞進行封接和破膜，記錄膜電容和各種處理因素膜電流的變化。
　　 5.使用鈣離子敏

8、感性指示劑Fluo-4/AM預處理細胞后，在激光共聚焦顯微鏡下監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子的變化情況。
　　 6.應用GST-pull down and Western blotting方法檢測活性Rac1，Rac2蛋白的表達。
　　 7.實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±SD)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理分析。三組及三組以上樣本均數(shù)比較滿足方差齊性用One-way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，采

9、用welch檢驗，組間兩兩比較采用Durnett's T3法。P＜0.05為存在顯著性差異。
　　 結果:
　　 1.fMLP可誘導中性粒細胞產(chǎn)生SOCE，并使膜電位增加。
　　 2.mβCD和CLM均能引起中性粒細胞膜電流的變化，與對照組或/和fMLP組比較，電流密度變化均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。mβCD破壞脂筏結夠完整性后抑制了fMLP誘導的細胞外鈣內(nèi)流，CLM可逆性恢復脂筏結構后細胞外鈣內(nèi)流增加。

10、r>　　 3.Zigmond chamber實驗顯示mβCD破壞細胞脂筏結構完整性后極性化率下降，CLM可逆性恢復脂筏結構完整性后極性化率上升。
　　 4.Transwell小室檢測中性粒細胞的遷移能力的變化實驗中，mβCD破壞細胞脂筏結構完整性后定向遷移能力顯著性下降，CLM恢復細胞脂筏結構完整性后中性粒細胞定向遷移能力與mβCD組相比顯著性增加。
　　 5.免疫印跡結果顯示fMLP刺激組顯示活化的Rac2、Rac1

11、的蛋白條帶最濃，當脂筏結構完整性用mβCD破壞后再進行fMLP刺激，則細胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶都比fMLP刺激組弱。而用CLM恢復細胞脂筏結構后則細胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶比mβCD組強但比fMLP刺激組弱。
　　 結論:
　　 1.fMLP可誘導中性粒細胞膜電流發(fā)生改變，這種改變可能參與介導SOCE的變化。
　　 2.破壞脂筏結構完整性的藥物(mβCD)能降低fMLP誘導極性細胞的