STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡與增殖的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：
　　STIM1（stromal interaction molecule1）最早是由Kenneth Stauderman及其研究團(tuán)隊(duì)在2005年發(fā)現(xiàn)的一種參與鈣庫調(diào)控的鈣離子內(nèi)流(Store-operated Ca2+entry, SOCE)的基因[1,2]。隨著對STIM1的研究深入發(fā)現(xiàn)STIM1在多種癌癥中都有異常表達(dá)，并參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[3-5]，但其在頭頸鱗癌（head and neck

2、 squamous cell carcinoma, HNSCC）中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在明確STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義，探討STIM1表達(dá)與頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡與增殖的關(guān)系，初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑。
　　方法：
　　1.收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頭頸鱗癌手術(shù)標(biāo)本蠟塊組織切片及對應(yīng)的正常組織切片共56對作為實(shí)驗(yàn)對象，應(yīng)用 IHC的方法檢測兩組組織標(biāo)本中 STIM1的相對表達(dá)

3、量。收集患者臨床資料，進(jìn)行5年總生存率分析。同時收集8組頭頸鱗癌患者手術(shù)過程留取的癌組織及切緣旁的正常組織，應(yīng)用蛋白免疫沉淀方法分析 STIM1在癌組織及正常組織中蛋白的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)獲取軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.篩選TSCCA及Hep2頭頸鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，采用lipofectamine3000介導(dǎo) STIM1-siRNA對兩個細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，應(yīng)用流式

4、細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258染色方法檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后兩組細(xì)胞凋亡率的差異；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后細(xì)胞周期分布變化。應(yīng)用WB檢測細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。篩選Tb3.1低表達(dá)STIM1細(xì)胞系進(jìn)行高表達(dá)體外實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率的變化；應(yīng)用fluo4/AM鈣離子探針檢測敲低 STIM1表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流情況；通過 WB檢測caspase12的表達(dá)初步探索STIM1調(diào)控頭頸

5、鱗癌細(xì)胞凋亡的主要途徑。
　　3.選取TSCCA細(xì)胞建立裸鼠皮下成瘤動物模型，分為對照組及si-STIM1處理組，成瘤后動態(tài)觀察腫瘤生長速度，取瘤測量兩組腫瘤質(zhì)量，制作組織切片應(yīng)用HE染色觀察腫瘤細(xì)胞核形態(tài)；免疫組化檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase12、Bcl-2、BAX及細(xì)胞周期相關(guān)基因P21、cyclinD1的表達(dá)情況，對體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1. IHC結(jié)果顯示STIM1在

6、頭頸鱗癌組織中的表達(dá)（6.286±0.259）高于癌旁組織（2.393±0.226），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。WB進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。STIM1表達(dá)與腫瘤大小及病理分級相關(guān)。STIM1高表達(dá)組5年OS為25.9％，低表達(dá)組5年OS為48.3%（P<0.05）。
　　2.篩選TSCCA及Hep2鱗癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染STIM1-siRNA，敲低STIM1的表達(dá)；篩選Tb3.1低表達(dá)STIM

7、1細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染STIM1高表達(dá)質(zhì)粒。應(yīng)用FACS及Hoechst33258染色法檢測STIM1細(xì)胞凋亡率：結(jié)果顯示敲低STIM1表達(dá)后TSCCA及Hep2細(xì)胞凋亡率增高（P<0.05），而Tb3.1細(xì)胞中STIM1高表達(dá)后細(xì)胞凋亡率下降（P<0.05）。WB檢測凋亡相關(guān)蛋白，STIM1敲低后凋亡基因caspase3、caspase12、BAX表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下降；轉(zhuǎn)染高表達(dá)STIM1質(zhì)粒后結(jié)果則相反。敲低STIM1表達(dá)后細(xì)胞周期

8、停滯在G0/G1期， WB結(jié)果驗(yàn)證了以上現(xiàn)象。
　　3.敲低STIM1表達(dá)后，應(yīng)用fluo-4鈣離子探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號，發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流減少，SOCE下降，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　4. TSCCA荷鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制STIM1表達(dá)后腫瘤生長速度和重量均明顯低于對照組（P<0.05）。HE染色顯示STIM1敲低組核分裂象及不典型增生減少。IHC結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染STIM1-siRNA組細(xì)胞漿caspase3、caspase

9、12、BAX、P21的表達(dá)均高于對照組，而Bcl2、cyclinD1表達(dá)則低于對照組。
　　結(jié)論：
　　1. STIM1在頭頸鱗癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤大小及病理分級相關(guān)，并與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示其在頭頸鱗癌中可能起到癌基因的作用；
　　2. STIM1影響頭頸鱗癌細(xì)胞的凋亡及增值，并參與SOCE過程，其參與凋亡的途徑為ER stress途徑；
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。STIM1可作為分析人頭頸鱗