STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細胞凋亡與增殖的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：
　　STIM1（stromal interaction molecule1）最早是由Kenneth Stauderman及其研究團隊在2005年發(fā)現(xiàn)的一種參與鈣庫調(diào)控的鈣離子內(nèi)流(Store-operated Ca2+entry, SOCE)的基因[1,2]。隨著對STIM1的研究深入發(fā)現(xiàn)STIM1在多種癌癥中都有異常表達，并參與多種腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[3-5]，但其在頭頸鱗癌（head and neck

2、 squamous cell carcinoma, HNSCC）中的表達及作用機制尚不清楚。本研究旨在明確STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達情況及臨床意義，探討STIM1表達與頭頸鱗癌細胞凋亡與增殖的關(guān)系，初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細胞凋亡的相關(guān)途徑。
　　方法：
　　1.收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頭頸鱗癌手術(shù)標本蠟塊組織切片及對應(yīng)的正常組織切片共56對作為實驗對象，應(yīng)用 IHC的方法檢測兩組組織標本中 STIM1的相對表達

3、量。收集患者臨床資料，進行5年總生存率分析。同時收集8組頭頸鱗癌患者手術(shù)過程留取的癌組織及切緣旁的正常組織，應(yīng)用蛋白免疫沉淀方法分析 STIM1在癌組織及正常組織中蛋白的表達水平。數(shù)據(jù)分析使用SPSS18.0統(tǒng)計獲取軟件包進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.篩選TSCCA及Hep2頭頸鱗癌細胞系進行體外實驗，采用lipofectamine3000介導 STIM1-siRNA對兩個細胞系進行轉(zhuǎn)染處理，應(yīng)用流式

4、細胞術(shù)及Hoechst33258染色方法檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后兩組細胞凋亡率的差異；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后細胞周期分布變化。應(yīng)用WB檢測細胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達量的變化。篩選Tb3.1低表達STIM1細胞系進行高表達體外實驗，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡率的變化；應(yīng)用fluo4/AM鈣離子探針檢測敲低 STIM1表達后細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流情況；通過 WB檢測caspase12的表達初步探索STIM1調(diào)控頭頸

5、鱗癌細胞凋亡的主要途徑。
　　3.選取TSCCA細胞建立裸鼠皮下成瘤動物模型，分為對照組及si-STIM1處理組，成瘤后動態(tài)觀察腫瘤生長速度，取瘤測量兩組腫瘤質(zhì)量，制作組織切片應(yīng)用HE染色觀察腫瘤細胞核形態(tài)；免疫組化檢測細胞凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase12、Bcl-2、BAX及細胞周期相關(guān)基因P21、cyclinD1的表達情況，對體外實驗進行進一步驗證。
　　結(jié)果：
　　1. IHC結(jié)果顯示STIM1在

6、頭頸鱗癌組織中的表達（6.286±0.259）高于癌旁組織（2.393±0.226），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。WB進一步證實了以上結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。STIM1表達與腫瘤大小及病理分級相關(guān)。STIM1高表達組5年OS為25.9％，低表達組5年OS為48.3%（P<0.05）。
　　2.篩選TSCCA及Hep2鱗癌細胞系中轉(zhuǎn)染STIM1-siRNA，敲低STIM1的表達；篩選Tb3.1低表達STIM

7、1細胞系，轉(zhuǎn)染STIM1高表達質(zhì)粒。應(yīng)用FACS及Hoechst33258染色法檢測STIM1細胞凋亡率：結(jié)果顯示敲低STIM1表達后TSCCA及Hep2細胞凋亡率增高（P<0.05），而Tb3.1細胞中STIM1高表達后細胞凋亡率下降（P<0.05）。WB檢測凋亡相關(guān)蛋白，STIM1敲低后凋亡基因caspase3、caspase12、BAX表達上調(diào)，Bcl-2表達下降；轉(zhuǎn)染高表達STIM1質(zhì)粒后結(jié)果則相反。敲低STIM1表達后細胞周期

8、停滯在G0/G1期， WB結(jié)果驗證了以上現(xiàn)象。
　　3.敲低STIM1表達后，應(yīng)用fluo-4鈣離子探針檢測細胞內(nèi)鈣離子信號，發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流減少，SOCE下降，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　4. TSCCA荷鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，抑制STIM1表達后腫瘤生長速度和重量均明顯低于對照組（P<0.05）。HE染色顯示STIM1敲低組核分裂象及不典型增生減少。IHC結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染STIM1-siRNA組細胞漿caspase3、caspase

9、12、BAX、P21的表達均高于對照組，而Bcl2、cyclinD1表達則低于對照組。
　　結(jié)論：
　　1. STIM1在頭頸鱗癌組織中呈高表達狀態(tài)，與腫瘤大小及病理分級相關(guān)，并與預后呈負相關(guān)，提示其在頭頸鱗癌中可能起到癌基因的作用；
　　2. STIM1影響頭頸鱗癌細胞的凋亡及增值，并參與SOCE過程，其參與凋亡的途徑為ER stress途徑；
　　3.體內(nèi)實驗與體外實驗結(jié)果相一致。STIM1可作為分析人頭頸鱗