慢性阻塞性肺疾病患者中性粒細(xì)胞的異常極性化及香煙提取物誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞極性化的機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)嚴(yán)重危害人類的健康，由其所引起的死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的5％，是造成慢性疾病高發(fā)病率和死亡率的重要因素之一。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)造成的死亡在未來的十年將會(huì)增加30％。課題組已經(jīng)從肺組織的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多個(gè)角度對(duì)其發(fā)病機(jī)制展開研究，而發(fā)病過程中趨化因子對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)的募集及其造成的炎癥反應(yīng)可能也是慢性阻塞性肺疾病(COPD)疾病啟動(dòng)和遷延

2、的重要原因，另一方面COPD外周血嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)遷移也存在著異常，表現(xiàn)為遷移的速度明顯增加但向趨化物方向遷移的數(shù)量降低，這導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)在整個(gè)肺組織中非定向的異常聚集，引起肺部的非特異性炎癥并損傷肺組織導(dǎo)致氣道炎癥及肺氣腫。
　　中性粒細(xì)胞是先天免疫應(yīng)答的重要組成部分，是機(jī)體抵御外來微生物病原體尤其是化膿性細(xì)菌的入侵的第一道防線。極性化形態(tài)的建立是中性粒細(xì)胞定向遷移到炎癥部位，發(fā)揮殺菌抗炎作用的前提，但中性

3、粒細(xì)胞不恰當(dāng)?shù)募せ顓s與臨床上一些疾病例如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)等密切相關(guān)。因此深入探討COPD患者中性粒細(xì)胞極性化情況及極性化過程的信號(hào)機(jī)制，對(duì)尋找新的治療和干預(yù)靶點(diǎn)，防止中性粒細(xì)胞不適當(dāng)激活導(dǎo)致的組織損傷具有重要意義。
　　吸煙在慢阻肺發(fā)病的危害作用被大量證實(shí)，廣東部分地區(qū)慢阻肺的流病學(xué)研究顯示，吸煙人群中僅有15.1％患慢阻肺，且吸煙量對(duì)慢阻肺患病率影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在SOCE通

4、過Akt-Src-Rho-GTPase信號(hào)通路參與fMLP刺激下的中性粒細(xì)胞的極性化，那么香煙提取物(CSE)引起的中性粒細(xì)胞的極性化趨化狀態(tài)是否與SOCE引起的Akt通過或Src通路的活化有關(guān)呢？這對(duì)于闡明吸煙在慢阻肺疾病的發(fā)病和致病機(jī)制中有一定的意義。
　　目的：
　　1.觀察正常不吸煙人群、正常吸煙人群和不同GOLD分級(jí)慢阻肺病人外周靜脈血中性粒細(xì)胞的極性化（自發(fā)極性化率以及fMLP梯度濃度刺激下的定向極性化率）的差異

5、。
　　2.檢測(cè)正常不吸煙人群、正常吸煙人群和不同GOLD分級(jí)慢阻肺病人外周靜脈血中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)重要功能成分:基質(zhì)交聯(lián)分子(STIM)1、2和Orai1的表達(dá)是否有差異。
　　3.檢測(cè)正常不吸煙人群、正常吸煙人群和不同GOLD分級(jí)慢阻肺病人外周靜脈血中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)所引起的細(xì)胞鈣內(nèi)流情況是否有差異。
　　4.通過檢測(cè)PI3K的下游標(biāo)志信號(hào)分子Akt磷酸化水平以及Src磷

6、酸化，及PI3K抑制劑和Akt抑制劑作用下香煙提取物誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的極性化情況，探討香煙提取物(CSE)刺激下中性粒細(xì)胞的極性化是否受經(jīng)典的PI3K信號(hào)通路調(diào)控。
　　5.探討SOCE抑制劑對(duì)香煙提取物刺激下中性粒細(xì)胞極性化、Akt磷酸化及Src磷酸化水平及細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的作用。
　　方法：
　　1.采用經(jīng)典的梯度密度離心的方法分離中性粒細(xì)胞，主要包括紅細(xì)胞沉降，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心和低滲裂解殘存的紅細(xì)胞三個(gè)步驟。

7、首先葡聚糖T-500（Dextran T-500）沉降紅細(xì)胞可以除去絕大多數(shù)紅細(xì)胞，接下來淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心可將外周血單個(gè)核白細(xì)胞與多型核白細(xì)胞分開，殘存的紅細(xì)胞通過低滲溶解快速移除。獲得的中性粒細(xì)胞分別進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)和瑞氏染色，分析細(xì)胞的活性和純度。細(xì)胞純度和活力分別大于95％和98％。
　　2.中性粒細(xì)胞用或不用2-APB，SKF96365，Ly249002或Deguelin預(yù)處理30分鐘，采用Zigmong Chambe

8、r建立fMLP或者香煙提取物(CSE)的線性濃度梯度，觀察中性粒細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后細(xì)胞形態(tài)變化及極性化情況。
　　3.運(yùn)用FV1000激光共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的方法檢測(cè)不同組志愿者中性粒細(xì)胞及2-APB，SKF96365對(duì)TG刺激SOCE和香煙提取物(CSE)刺激的鈣內(nèi)流的影響。
　　4.通過Western blot的方法，用2-APB，SKF96365，Ly249002或Deguelin處理中性粒細(xì)胞3

9、0min，觀察其對(duì)香煙提取物(CSE)刺激的Akt磷酸化及Src磷酸化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.慢阻肺Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)志愿者的外周血中性粒細(xì)胞在沒有fMLP梯度濃度刺激下發(fā)生的自發(fā)極性化率均顯著高于健康不吸煙組、健康吸煙組。[（15.70±8.01）％，P＜0.05，（27.50±11.99）％、（24.21±8.45）％、（18.13±6.56）％比（7.99±3.91）％、（5.76±4.81）％，均P＜0.0

10、1];健康不吸煙組與健康吸煙組自發(fā)極性化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在fMLP梯度濃度刺激下，各組外周血中性粒細(xì)胞向刺激來源fMLP方向發(fā)生的定向極性化的比例均顯著低于健康不吸煙組和健康吸煙組[(2.75±1.27)％，（3.52±1.29）％、（3.83±1.82）％、（3.06±0.62）％比（7.44±3.31）％、（8.44±3.47）％，均P＜0.01]。健康不吸煙組與健康吸煙組在fMLP梯度濃度刺激下的定向極性化率差

11、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.四個(gè)慢阻肺疾病組中性粒細(xì)胞由TG引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫清空導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高程度較兩對(duì)照組降低約30％，由此引起的細(xì)胞外鈣內(nèi)流即SOCE與對(duì)照組相比降低約60％。
　　4.四個(gè)慢阻肺組SOCE的重要組成成分:基質(zhì)交聯(lián)蛋白(STIM)1、2及Orai1表達(dá)均顯著高于健康不吸煙組、健康吸煙組（均P＜0.01）。
　　5.0.5％的香煙提取物引起中性粒細(xì)胞最大定向極性化率。對(duì)照組中性粒細(xì)胞在香煙提取物

12、(CSE)梯度濃度刺激下的定向趨化極性化率為(41.49±4.76)％;而用SKF96365(40μ M)或2-APB(100μ M)預(yù)處理30min后，中性粒細(xì)胞的定向趨化極性化率分別降至(19.09±1.83)％和(14.06±1.62)％(P=0.000; P=0.000)，存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.TG刺激的中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清空引起了細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，即第一個(gè)峰時(shí)對(duì)照組和藥物處理組（SKF96365及2-APB）的相對(duì)

13、值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.556，P=0.285);而第二個(gè)峰，即SOCE所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣水平的相對(duì)值統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，（F=14.941，P=0.000），對(duì)照組的相對(duì)值分別被SKF96365及2-APB抑制了30％和45％左右(P=0.000; P=0.000)。將刺激物TG換成CSE，鈣庫清空所致的第一個(gè)峰，對(duì)照組和藥物處理組(SKF96365及2-APB)的相對(duì)值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.082，P=0.206）;而對(duì)第二個(gè)峰所選取的相

14、對(duì)值統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，(F=749.394，P=0.000)，對(duì)照組的相對(duì)值分別被SKF96365及2-APB抑制了30％和60％左右(P=0.000; P=0.000)。
　　7.與對(duì)照組相比，中性粒細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的香煙提取物刺激后細(xì)胞極性化率顯著性上調(diào)(F=66.533，P=0.000)。用PI3K抑制劑(Ly249002)和Akt抑制劑(Deguelin)預(yù)處理中性粒細(xì)胞30min后，與未處理組相比，香煙提取物刺激的細(xì)胞定向極

15、性化率顯著性降低(P=0.000; P=0.000)。
　　8.香煙提取物不同刺激時(shí)間點(diǎn)間的Akt磷酸化及Src磷酸化的相對(duì)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.376，P=0.004; F=41.57，P=0.000)，LSD法兩兩比較發(fā)現(xiàn)CSE刺激15min時(shí)Akt或Src的磷酸化相對(duì)于control組（CSE刺激0s）顯著增高（P=0.000; P=0.000）;從均值上看，CSE刺激15min時(shí)的Src以及Akt磷酸化相對(duì)值達(dá)到最高。<

16、br>　　9.與對(duì)照組相比，經(jīng)香煙提取物刺激的中性粒細(xì)胞的Akt和Src磷酸化水平顯著升高（F=4.681，P=0.013）。SKF96365和2-APB預(yù)處理中性粒細(xì)胞后，與未處理組相比，CSE刺激的Src磷酸化的水平顯著性降低(P=0.011;P=0.036)。而不同藥物處理組的Akt磷酸化相對(duì)值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從均值上看，各藥物處理組的Akt磷酸化均較CSE刺激組降低。
　　結(jié)論：
　　1.與健康不吸煙組與健康吸煙組

17、相比，慢阻肺患者的外周靜脈血中性粒細(xì)胞自發(fā)極性化率明顯增高而定向極性化率明顯降低，即慢阻肺患者的中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)出大量而不精準(zhǔn)的極性化趨化狀態(tài)。
　　2.與健康不吸煙組與健康吸煙組相比，慢阻肺患者外周靜脈血中性粒細(xì)胞鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)的重要功能組分基質(zhì)相互作用分子(STIM)1、2和Orai1蛋白表達(dá)明顯升高;且由其引起的細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高的峰值明顯降低。即，慢阻肺患者的中性粒細(xì)胞SOCE的組分和功能存在異常。
　　3