PSY、LCYE基因在番茄紅素合成途徑的功能研究.pdf

1、番茄紅素是植物中的一種天然色素，屬于類胡蘿卜素的一種，也是目前在自然界的植物中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一，能夠通過物理和化學(xué)方式猝滅單線態(tài)氧或捕捉過氧化自由基，其清除自由基的功效遠(yuǎn)勝于其他類胡蘿卜素和維生素 E。除了具有強(qiáng)的抗氧化作用外，番茄紅素還能夠通過各種途徑阻斷組織細(xì)胞在外界誘變劑作用下發(fā)生基因突變。同時(shí)，番茄紅素還是一種低膽甾醇劑，它可以抑制膽固醇生物合成。
　　番茄紅素的合成過程包括縮合、脫氫、環(huán)化、羥基化及環(huán)氧化等一系列反

2、應(yīng)，其中八氫番茄紅素合成酶(PSY)催化2分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)合成1分子的八氫番茄紅素，八氫番茄紅素再通過八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)和ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)的作用生成番茄紅素。番茄紅素有兩條主要的代謝途徑，其中一條是通過LCYE的催化生成α-胡蘿卜素，并進(jìn)一步生成葉黃素；另外一條是通過LCYB的催化生成β-胡蘿卜素，而β-胡蘿卜素是脫落酸(ABA)的前體。
　　目的：番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、胡蘿卜

3、、胡椒等各種水果和蔬菜中，其中番茄果實(shí)是番茄紅素最主要的來源，因而培育高含量番茄紅素的番茄果實(shí)成為一大研究熱點(diǎn)。本研究試圖通過基因工程手段，培育出高番茄紅素的轉(zhuǎn)基因番茄種質(zhì)。
　　方法：以pBI121為載體骨架，用果實(shí)特異性表達(dá)的E8啟動子構(gòu)建番茄紅素合成基因PSY的果實(shí)特異性過表達(dá)載體；以pCAMBIA1301為載體骨架，同樣用E8啟動子構(gòu)建番茄紅素代謝基因LCYE的‘hairpin’RNA(hpRNA)的果實(shí)特異性RNAi表達(dá)

4、載體；用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化加工番茄里格87-5；PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株；實(shí)時(shí)定量 PCR方法測定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；最后再以分光光度計(jì)測定轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中番茄紅素的含量。
　　結(jié)果與結(jié)論：1、以加工番茄DNA/RNA為模板，PCR擴(kuò)增分別得到了167bp的LCYE基因的第三個(gè)內(nèi)含子、2207bp的E8啟動子、1280bp的PSY基因，以及337bp的LCYE基因保守序列；其中內(nèi)含子兩側(cè)分別添加了4對同尾酶，PSY基因的末端添加了H

5、A標(biāo)簽序列；測序結(jié)果表明成功擴(kuò)增出了相關(guān)目的條帶。
　　2、將內(nèi)含子片段插入pBI221載體，構(gòu)建出含有內(nèi)含子間隔序列的中間載體pRi221；利用pRi221中內(nèi)含子兩側(cè)的2對同尾酶將LCYE保守序列依次以正向和反向方式分別插入內(nèi)含子兩側(cè)，構(gòu)建出載體pRiE8-Lcye；將干擾片段與表達(dá)載體pCAMBIA1301相連接，最終構(gòu)建出果實(shí)特異性RNAi表達(dá)載體 pCRiE8-Lcye。構(gòu)建過程中的所有載體均經(jīng)過雙酶切或 PCR檢測，得

6、到了預(yù)期條帶，此外對過量及RNAi兩個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行了測序，測序結(jié)果表明表達(dá)載體均構(gòu)建正確。
　　3、攜帶PSY過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌以葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，得到了6棵植株，PCR檢測均擴(kuò)增出了預(yù)期條帶，表明成功得到了6棵PSY過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄；攜帶LCYE RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同樣以葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，得到了1棵植株，PCR檢測擴(kuò)增出了預(yù)期條帶，表明成功得到了1棵LCYE干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄。
　　轉(zhuǎn)基因番茄中基因的表達(dá)水平以及番