皮質酮預處理對脂多糖激活小膠質細胞的調節(jié)作用及雞豆黃素A的保護作用.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的好發(fā)于中老年人的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，病理特征是多巴胺（dopamine，DA）神經元進行性變性、凋亡。目前關于該病的確切發(fā)病機制尚不知曉，但神經炎癥與PD的發(fā)生有著密切的關系。抑郁癥是一種全球性精神疾病，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，目前研究顯示神經炎癥可以促進抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。研究顯示慢性不可預見性應激（Chronc Unpredictable Mide Stre

2、ss,CUMS）導致的下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic–pituitary–adrena axis, HPA）軸亢奮，皮質酮（Corticosterone，CORT）分泌異?？芍乱钟舻陌l(fā)生。另外也有研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者較非抑郁患者更易罹患PD，揭示抑郁可能為PD的獨立危險因素。雞豆黃素A（Biochanin A，BioA）作為植物類雌激素可以抑制小膠質細胞的活化，但在抑郁伴PD模型中是否有這樣的作用及其可能的作用機制尚不明確

3、。
　　目的：研究CORT預處理對LPS激活小膠質細胞的調節(jié)作用，雞豆黃素A對小膠質細胞活化的抑制作用。
　　方法：1.采用MTT法，檢測LPS對BV2的激活作用，篩選出適宜的造模濃度。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為6組：（1）Control組；（2）LPS（0.01μg/ml）組；（3）LPS（0.1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）組；（5）LPS（10μg/ml）組；（6） LPS（100μg/ml）組，除Con

4、trol外，其余每組加入相應濃度的LPS孵育36h。
　　2.采用MTT法，檢測雞豆黃素A對BV2的損傷作用，篩選出適宜的保護藥物濃度。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為6組：（1）Control組；（2）BioA（2.5μM）組；（3）BioA（5μM）組；（4）BioA（10μM）組；（5）BioA（20μM）組；（6） BioA（40μM）組。除Control外，其余每組加入相應濃度的BioA孵育36h。
　　3.采用Geri

5、ss法檢測各組細胞上清液中的NO含量來觀察不同濃度的皮質酮預處理對LPS激活小膠質細胞的調節(jié)作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為7組：（1） Control組；（2）LPS（1μg/ml）組；（3）CORT（25nM）+LPS（1μg/ml）組；（4） CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組；（5）CORT（100nM）+LPS（1μg/ml）組；（6）CORT（200nM）+LPS（1μg/ml）組；（7）CORT（400nM）+

6、LPS（1μg/ml）組。除Control外，各組先加入不同濃度的CORT孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）共同孵育36h。
　　4.采用Geriss法檢測各組細胞上清液中的NO含量來觀察皮質酮預處理對LPS激活小膠質細胞的調節(jié)作用及BioA對細胞的保護作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4） LPS（1μg/ml）+CO

7、RT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h。
　　5.用顯微鏡直接觀察各組細胞的細胞形態(tài)變化和DCFH-DA探針法檢測各組細胞的ROS情況來檢測皮質酮預處理對LPS激活小膠質細胞的調節(jié)作用及BioA對細胞的保護作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5

8、組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5） LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h。
　　6.用Western-blot法檢測各組BV2細胞中5-HTT的蛋白

9、表達水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進行檢測。
　　7.用West

10、ern-blot法檢測各組BV2細胞中GR和MR的蛋白表達水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵

11、育36h后提取蛋白進行檢測。
　　8.用Western-blot法檢測各組BV2細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵

12、育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進行檢測。
　　9.用Western-blot法檢測各組BV2細胞中炎癥小體相關蛋白ASC、Caspase-1和NLRP3的蛋白表達水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）

13、+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進行檢測。
　　結果：
　　1.與對照組相比，LPS濃度在1μg/ml以下，細胞的活力呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，當濃度在1μg/ml以上時，細胞的活力又開始出現(xiàn)下降。因而，1μg/ml的LPS是我們實驗所需的適宜的濃度。
　　2.雞豆

14、黃素A濃度在5μM時對細胞基本上沒有損傷的作用，當濃度繼續(xù)增加，BioA會對細胞產生損傷。因而5μM的LPS是我們實驗所需的適宜的濃度。
　　3.CORT濃度在50 nM可以促進LPS誘導BV2細胞產生大量的NO，細胞出現(xiàn)明顯的活化。因而，50 nM的CORT是我們實驗所需的濃度。
　　4.LPS（1μg/ml）組BV2細胞的上清液中NO含量相比于對照組明顯升高；與LPS（1μg/ml）組相比，CORT（50nM）+LPS（

15、1μg/ml）組BV2細胞的上清液中NO含量明顯升高；與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）BV2細胞的NO含量明顯降低。
　　5.與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組的細胞的ROS的表達量更高，活化狀態(tài)的―阿米巴‖狀細胞也更多；與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比CORT（

16、50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）細胞的ROS表達量較低，形態(tài)較趨于正常。
　　6.Western-blot檢測顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細胞的5-HTT的蛋白表達量降低；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組5-HTT蛋白表達量較CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組升高。
　　7. Wes

17、tern-blot檢測顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細胞的GR的蛋白表達量降低，MR的表達量升高；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組MR、GR蛋白表達量與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比，GR表達量升高，MR表達量下降。
　　8. Western-blot檢測顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml

18、）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細胞的炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的蛋白表達量升高；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組上述蛋白與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比，其蛋白表達量與上述結果相反。
　　9. Western-blot檢測顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細胞的NLRP3