皮質(zhì)酮預(yù)處理對(duì)脂多糖激活小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及雞豆黃素A的保護(hù)作用.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見(jiàn)的好發(fā)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病理特征是多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元進(jìn)行性變性、凋亡。目前關(guān)于該病的確切發(fā)病機(jī)制尚不知曉，但神經(jīng)炎癥與PD的發(fā)生有著密切的關(guān)系。抑郁癥是一種全球性精神疾病，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，目前研究顯示神經(jīng)炎癥可以促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。研究顯示慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激（Chronc Unpredictable Mide Stre

2、ss,CUMS）導(dǎo)致的下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic–pituitary–adrena axis, HPA）軸亢奮，皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）分泌異常可致抑郁的發(fā)生。另外也有研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者較非抑郁患者更易罹患PD，揭示抑郁可能為PD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。雞豆黃素A（Biochanin A，BioA）作為植物類雌激素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，但在抑郁伴PD模型中是否有這樣的作用及其可能的作用機(jī)制尚不明確

3、。
　　目的：研究CORT預(yù)處理對(duì)LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，雞豆黃素A對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用。
　　方法：1.采用MTT法，檢測(cè)LPS對(duì)BV2的激活作用，篩選出適宜的造模濃度。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為6組：（1）Control組；（2）LPS（0.01μg/ml）組；（3）LPS（0.1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）組；（5）LPS（10μg/ml）組；（6） LPS（100μg/ml）組，除Con

4、trol外，其余每組加入相應(yīng)濃度的LPS孵育36h。
　　2.采用MTT法，檢測(cè)雞豆黃素A對(duì)BV2的損傷作用，篩選出適宜的保護(hù)藥物濃度。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為6組：（1）Control組；（2）BioA（2.5μM）組；（3）BioA（5μM）組；（4）BioA（10μM）組；（5）BioA（20μM）組；（6） BioA（40μM）組。除Control外，其余每組加入相應(yīng)濃度的BioA孵育36h。
　　3.采用Geri

5、ss法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的NO含量來(lái)觀察不同濃度的皮質(zhì)酮預(yù)處理對(duì)LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為7組：（1） Control組；（2）LPS（1μg/ml）組；（3）CORT（25nM）+LPS（1μg/ml）組；（4） CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組；（5）CORT（100nM）+LPS（1μg/ml）組；（6）CORT（200nM）+LPS（1μg/ml）組；（7）CORT（400nM）+

6、LPS（1μg/ml）組。除Control外，各組先加入不同濃度的CORT孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）共同孵育36h。
　　4.采用Geriss法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的NO含量來(lái)觀察皮質(zhì)酮預(yù)處理對(duì)LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及BioA對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4） LPS（1μg/ml）+CO

7、RT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h。
　　5.用顯微鏡直接觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化和DCFH-DA探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞的ROS情況來(lái)檢測(cè)皮質(zhì)酮預(yù)處理對(duì)LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及BioA對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5

8、組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5） LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h。
　　6.用Western-blot法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞中5-HTT的蛋白

9、表達(dá)水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　7.用West

10、ern-blot法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞中GR和MR的蛋白表達(dá)水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵

11、育36h后提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　8.用Western-blot法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵

12、育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　9.用Western-blot法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞中炎癥小體相關(guān)蛋白ASC、Caspase-1和NLRP3的蛋白表達(dá)水平。將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞分為5組：（1）Control組；（2）CORT（50nM）組；（3）LPS（1μg/ml）組；（4）LPS（1μg/ml）+CORT（50nM）組；（5）LPS（1μg/ml）

13、+CORT（50nM）+BioA（5μM）組。除Control外，各組先加入CORT（50nM）孵育2h，然后各組加入相應(yīng)濃度的LPS（1μg/ml）和BioA（5μM）共同孵育36h后提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，LPS濃度在1μg/ml以下，細(xì)胞的活力呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)，當(dāng)濃度在1μg/ml以上時(shí)，細(xì)胞的活力又開始出現(xiàn)下降。因而，1μg/ml的LPS是我們實(shí)驗(yàn)所需的適宜的濃度。
　　2.雞豆

14、黃素A濃度在5μM時(shí)對(duì)細(xì)胞基本上沒(méi)有損傷的作用，當(dāng)濃度繼續(xù)增加，BioA會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。因而5μM的LPS是我們實(shí)驗(yàn)所需的適宜的濃度。
　　3.CORT濃度在50 nM可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的活化。因而，50 nM的CORT是我們實(shí)驗(yàn)所需的濃度。
　　4.LPS（1μg/ml）組BV2細(xì)胞的上清液中NO含量相比于對(duì)照組明顯升高；與LPS（1μg/ml）組相比，CORT（50nM）+LPS（

15、1μg/ml）組BV2細(xì)胞的上清液中NO含量明顯升高；與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）BV2細(xì)胞的NO含量明顯降低。
　　5.與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組的細(xì)胞的ROS的表達(dá)量更高，活化狀態(tài)的―阿米巴‖狀細(xì)胞也更多；與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比CORT（

16、50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）細(xì)胞的ROS表達(dá)量較低，形態(tài)較趨于正常。
　　6.Western-blot檢測(cè)顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細(xì)胞的5-HTT的蛋白表達(dá)量降低；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組5-HTT蛋白表達(dá)量較CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組升高。
　　7. Wes

17、tern-blot檢測(cè)顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細(xì)胞的GR的蛋白表達(dá)量降低，MR的表達(dá)量升高；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組MR、GR蛋白表達(dá)量與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比，GR表達(dá)量升高，MR表達(dá)量下降。
　　8. Western-blot檢測(cè)顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml

18、）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細(xì)胞的炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)量升高；CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）+BioA（5μM）組上述蛋白與CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組相比，其蛋白表達(dá)量與上述結(jié)果相反。
　　9. Western-blot檢測(cè)顯示與CORT（50nM）組和LPS（1μg/ml）組相比CORT（50nM）+LPS（1μg/ml）組細(xì)胞的NLRP3