硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(TGR)在日本血吸蟲生長發(fā)育中部分功能的研究.pdf

1、血吸蟲病(Schistosomiasis)是由血吸蟲(Schistosome)感染所引起的一種嚴(yán)重危害人、畜健康的寄生蟲病，流行于全球74個國家和地區(qū)，約有5-6億人受到威脅。目前，防治血吸蟲病的主要策略是依賴于治療藥物吡喹酮的廣泛應(yīng)用，然而，防治實踐已表明單依靠藥物治療不能解決重復(fù)感染的問題，并且，藥物的不斷使用可能會引起抗藥性蟲株的出現(xiàn)。因此，篩選、鑒定新的抗血吸蟲病的候選疫苗分子和藥物靶標(biāo)顯得尤為重要。
　　血吸蟲生活在宿主

2、的血管中，需要氧化還原酶來抵抗宿主免疫系統(tǒng)或者血吸蟲自身代謝產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)，血吸蟲缺乏過氧化氫酶，也沒有TrxR和GR這兩種酶，取而代之的是一種多功能酶——硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(TGR)，該酶具有TrxR、GR和Grx三種酶的功能。鑒于這種獨特性，對TGR的研究受到寄生蟲學(xué)者的重視。本文以rSjTGR作為研究對象，開展了動物免疫保護(hù)效果評估及機(jī)制分析，酶特性和基因功能分析，以及金諾芬對SjTGR抑制作用分析，為深入了解

3、SjTGR在日本血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供了基礎(chǔ)。
　　1、重組日本血吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)免疫保護(hù)作用及機(jī)制分析
　　應(yīng)用重組蛋白硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶rSjTGR開展了小鼠免疫保護(hù)試驗，結(jié)果顯示，在兩次獨立的免疫保護(hù)試驗中，rSjTGR分別誘導(dǎo)了33.5％和36.51％的減蟲率，平均值為35.00％，并且還誘導(dǎo)了33.73％和43.44％的肝臟減卵率，平均值為38.58％。該結(jié)果與佐劑對照組相比，差

4、異非常顯著(P＜0.01)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步應(yīng)用ELISA技術(shù)對rSjTGR誘導(dǎo)的免疫保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明，rSjTGR誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生了較高水平的IgG1特異性抗體和IFN-γ，提示rSjTGR誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了Th1和Th2混合型，但偏向于Th1型的免疫應(yīng)答。研究結(jié)果表明rSjTGR值得作為日本血吸蟲病候選疫苗分子進(jìn)行深入的研究。
　　2、重組日本血吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)酶活性及抗氧化作用分

5、析
　　本研究應(yīng)用酶學(xué)分析技術(shù)分析了重組蛋白rSjTGR的酶活性，結(jié)果顯示，rSjTGR具有TrxR、GR和Grx三種酶的活性，分別為1.877±0.169 U/mg，0.8±0.01 U/mg,51.286±4.62 U/mg。該重組蛋白發(fā)揮作用的最適溫度為25℃，最佳pH值為7。本研究還分析了rSjTGR的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)rSjTGR主要靠清除活性氧參與抗氧化作用，而對H2O2沒有直接清除作用。本研究證明了重組蛋白SjTGR具

6、有酶活性，為深入研究rSjTGR的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　3、RNA干擾日本血吸蟲TGR基因?qū)οx體生長發(fā)育的影響
　　本研究針對TGR基因合成了4對小RNA分子(siRNAs):S1 siRNA、S2 siRNA、S3 siRNA和S4 siRNA，通過體內(nèi)、體外干擾試驗分析siRNAs對SjTGR的沉默效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外試驗中，S2 siRNA在濃度為200 nM時可以在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上引起部分TGR基因表達(dá)的下調(diào)

7、。在感染過日本血吸蟲的小鼠體內(nèi)，與對照組相比，S2siRNA處理組分別誘導(dǎo)了23.16％和36.19％的減蟲率，平均值為29.68％。并且，S2siRNA處理組中的蟲體TrxR酶活性下降。本研究結(jié)果表明，SjTGR在日本血吸蟲生長發(fā)育中具有重要的作用。
　　4、日本血吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)作為金諾芬(AF)藥物靶標(biāo)分析
　　金諾芬是一種對某些硒蛋白有抑制作用的含金化合物。本研究通過體內(nèi)、外試驗探討了AF對

8、SjTGR的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12.5μM的AF對rSjTGR的抑制作用高達(dá)64.29％，但隨著AF的濃度升高，抑制效果并不會隨之升高。此外，通過對不同期別蟲體的分析，發(fā)現(xiàn)AF對成蟲SjTGR的抑制效果低于對童蟲的效果，分析可能與蟲體對環(huán)境和應(yīng)激的適應(yīng)性有關(guān)。AF作用童蟲3h后，童蟲全部死亡。10μM的AF作用于成蟲1h后，提取蟲體蛋白檢測TrxR、GR和Grx的活性發(fā)現(xiàn)，抑制效果分別為85％、69％和58％。體內(nèi)注射AF的BALB/