日本血吸蟲組織蛋白酶L樣基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、血吸蟲病是由于人或哺乳動(dòng)物感染了血吸蟲所引起的一種疾病。在我國，血吸蟲病仍然流行于長江以南的12個(gè)省市自治區(qū)，未得到完全控制。血吸蟲寄生在終宿主的血管內(nèi)，以宿主紅細(xì)胞為主要食物和營養(yǎng)物質(zhì)來源，通過分解宿主紅細(xì)胞的血紅蛋白來獲得生長發(fā)育所需的氨基酸，但對(duì)于血吸蟲分解血紅蛋白的具體分子機(jī)制迄今還是未知。近年來研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B、C、D和L在紅細(xì)胞的降解過程中發(fā)揮了重要作用，其中組織蛋白酶L又是血吸蟲消化道內(nèi)的一種重要組織蛋白酶，對(duì)血吸蟲降

2、解血紅蛋白及血吸蟲的自身繁殖起非常重要的作用。該蛋白和人類的組織蛋白酶L有較大的差異，有望成為新的抗血吸蟲病藥物的作用靶點(diǎn)或疫苗研究的目標(biāo)蛋白。而且日本血吸蟲的組織蛋白酶L又可能可以激活TGF-β，在TGF-β發(fā)揮復(fù)雜的功能前起作用。因此，血吸蟲組織蛋白酶L基因的克隆及功能的研究有助于探索血吸蟲致病的分子機(jī)制，對(duì)于提高血吸蟲病的防治水平具有重要意義。 研究目的： 本研究根據(jù)日本血吸蟲組織蛋白酶L2(SjCL2)基因設(shè)計(jì)引

3、物，以期克隆該基因。但測序證實(shí)為類似sjCL2的未知功能基因SjCLs，采用基因克隆和重組表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建日本血吸蟲組織蛋白酶L樣(SjCLs)基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)得到重組蛋白后，研究SjCLs的性質(zhì)及功能。 研究方法： (1)提取日本血吸蟲成蟲總RNA，并根據(jù)已知SjCL2基因序列設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR和PCR擴(kuò)增SjCLs基因。將目的基因連接至pMD18-T Simple載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10

4、，重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定。采用Clustal W軟件對(duì)SjCLs基因與GeneBank發(fā)表的其它組織蛋白酶基因進(jìn)行比對(duì)。再利用生物信息學(xué)網(wǎng)站ExPASy及SWISS提供的軟件對(duì)本研究克隆到的SjCLs基因與同源性最高組織蛋白酶L基因——SjCL2進(jìn)行比較分析，預(yù)測二者之間結(jié)構(gòu)和功能的差異。 (2)將SjCLs基因定向亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)，構(gòu)建pET-SjCLs原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(

5、DE3)以建立表達(dá)SjCLs重組融合蛋白的工程菌株。用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，使上述工程菌株高效表達(dá)目的蛋白。目的表達(dá)產(chǎn)物采用Ni-NTA Agarose親和層析柱進(jìn)行純化，對(duì)表達(dá)的重組融合蛋白及純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析和免疫反應(yīng)性檢測。以Z-Phe-Arg-Nmec為底物，測定融合蛋白的酶活性。 (3)采用兔抗鼠TGF-β1血清，對(duì)日本血吸蟲尾蚴cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選，對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將大于50

6、0 bp的克隆進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)復(fù)篩陽性的克隆進(jìn)行測序和生物信息學(xué)鑒定。 結(jié)論： (1)從日本血吸蟲中克隆到一個(gè)新的類似SjCL2的組織蛋白酶L基因——SjCLs，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)獲得了大量的重組蛋白，該重組蛋白具有類似于SjCL2的酶活性，說明SjCLs基因是組織蛋白酶L家族的一個(gè)成員。 (2)SjCHGC蛋白與兔抗鼠TGF-β1抗體的反應(yīng)為交叉反應(yīng)，用抗某一蛋白的抗體篩選表達(dá)文庫得到相應(yīng)蛋