BDNF通過上調(diào)Rab8-GTP水平調(diào)控突觸后膜AMPA受體的局部運輸.pdf

1、目的及背景:
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子中的重要成員，不僅能促進神經(jīng)元的存活與分化，樹突和軸突的生長，而且在調(diào)節(jié)突觸可塑性過程中起到關(guān)鍵作用。突觸可塑性通常被認為是學習與記憶的分子基礎(chǔ)，在神經(jīng)元信息傳遞過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在突觸前膜，BDNF通過調(diào)控膜泡分泌促進遞質(zhì)釋放實現(xiàn)對突觸前膜可塑性的調(diào)節(jié);而在突觸后膜，BDNF往往是通過調(diào)控

2、離子型谷氨酸受體，特別是AMPA受體(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptors)的分布和數(shù)量來實現(xiàn)對突觸后膜可塑性的調(diào)控。樹突棘(spine)是神經(jīng)元的特化結(jié)構(gòu)，分布于神經(jīng)元的樹突上，一般呈蘑菇頭狀。樹突棘中有突觸后致密質(zhì)，是突觸后膜的特化結(jié)構(gòu)，樹突棘可以與突觸前膜和突觸間隙組成一個完整的突觸結(jié)構(gòu)，介導化學信號的傳導。雖然已有文獻報道BDNF可

3、以上調(diào)AMPA受體在神經(jīng)元整體膜表面的含量，但是BDNF是否能調(diào)控AMPA受體在spine部位的膜表面含量，還有待進一步研究。
　　小GTP酶蛋白中的Rab家族參與細胞內(nèi)的膜泡運輸過程，那么Rab分子是否也能參與調(diào)控突觸后膜，特別是spine處細胞內(nèi)的膜泡運輸過程呢？目前研究報道Rab8參與調(diào)控細胞內(nèi)膜泡從高爾基體TGN區(qū)運往細胞膜的過程，對神經(jīng)元的極性運輸起著關(guān)鍵作用。且有研究證實，Rab8在AMPA受體運往spine膜表面的過

4、程中是必要的，特別是在AMPA受體上膜的過程至關(guān)重要。然而，在BDNF調(diào)控AMPA受體在突觸后膜的運輸過程中，Rab8是否參與以及如何發(fā)揮作用，目前尚不清楚。本文采用分子細胞學方法證實BDNF能夠通過增加Rab8-GTP的含量從而特異性上調(diào)GluA1（AMPA受體的一種亞基）在spine膜表面的分布，而且這個過程是由PLCγ-Rabin3信號介導實現(xiàn)的。本研究將為人們闡明學習與記憶的具體分子機制提供一個新的角度。
　　方法:

5、>　　1.各種表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染。
　　3.免疫熒光定量檢測AMPA受體在spine處的膜表面水平。
　　4.胞漿蛋白與膜蛋白的分離。
　　5.GST-pull down及Western Blot。
　　結(jié)果:
　　1.BDNF調(diào)控GluA1在spine處的膜表面水平。
　　通過免疫熒光的實驗方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min，不僅能夠顯著升高s

6、pine處GluA1蛋白的整體水平，同時還能上調(diào)spine膜表面GluA1蛋白的含量。
　　2.BDNF不影響GluA2在spine處的膜表面水平。
　　通過免疫熒光的實驗方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min，雖然能夠顯著升高spine處GluA2蛋白的整體水平，卻不影響spine膜表面GluA2蛋白的含量。
　　3.BDNF通過影響Rab8形式轉(zhuǎn)換上調(diào)GluA1在spine膜表面的分布。
　　通

7、過免疫熒光的方法，我們發(fā)現(xiàn)在過表達Rab8功能缺失突變體(Rab8dn)后，BDNF不再上調(diào)GluA1蛋白在spine膜表面的含量;過表達Rab11功能缺失突變體(Rab11dn)后，BDNF不能上調(diào)spine處GluA1蛋白的整體水平。
　　4.BDNF上調(diào)Rab8-GTP水平。
　　通過胞漿-膜蛋白分離及GST pull down兩種實驗方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min后能夠顯著上調(diào)神經(jīng)元中Rab8-

8、GTP的蛋白水平。
　　5.BDNF通過Rabin3蛋白上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過GST-JFC1 pull down方法，我們發(fā)現(xiàn)干擾掉Rabin3后，BDNF不再上調(diào)Rab8-GTP。
　　6.BDNF通過TrkB-PLCγ-PKC信號通路上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過GST-JFC1 pull down方法，我們發(fā)現(xiàn)在給予Trk激酶的抑制劑K252a，PLCγ信號通路抑制劑U73

9、122和PKC信號通路抑制劑CHE時，BDNF不再上調(diào)Rab8-GTP。
　　7.BDNF通過PLCγ-Rabin3信號通路上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過GST-JFC1 pull down實驗，我們發(fā)現(xiàn)干擾掉Rabin3，再給予PKC信號通路的激動劑后，BDNF不再上調(diào)神經(jīng)元中Rab8-GTP的蛋白水平。
　　結(jié)論:
　　通過一系列的細胞分子生物學實驗方法，我們證實了BDNF能夠通過上調(diào)Rab8-G