順鉑通過上調(diào)死亡受體4、5的表達(dá)放大TRAIL誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的體外研究.pdf

1、目的：宮頸癌是世界范圍內(nèi)威脅婦女健康和生命的主要惡性疾病，是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因。對于晚期宮頸癌和宮頸癌復(fù)發(fā)病例，化療仍然是主要的治療方法。但如果化療藥物長期大量的應(yīng)用，藥物在作用于腫瘤的同時還會引起嚴(yán)重的副反應(yīng)，而且可導(dǎo)致腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。尋求高效、低毒的化療方法用于宮頸癌的治療，特別是晚期宮頸癌的治療，一直是臨床醫(yī)生努力探詢的問題。TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducing

2、 ligand)又名Ap02L，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子TNF家族成員，因其能夠選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但不影響正常細(xì)胞的生長分化，使其在腫瘤治療方面具有潛在的應(yīng)用價值，有望成為沒有毒副作用的新型化療藥物。本研究以人宮頸癌Hela和Caski細(xì)胞株為對象，體外研究TRAIL在宮頸癌治療中的可行性，以及TRAIL與傳統(tǒng)的化療藥物順鉑聯(lián)用時對宮頸癌細(xì)胞生長的影響及其作用機(jī)理，從而為TRAIL為應(yīng)用于宮頸癌的治療提供實驗室數(shù)據(jù)。

3、 方法： 1、細(xì)胞培育：常規(guī)復(fù)蘇凍存的Hela、Caski細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育，以0.25％胰蛋白酶消化傳代。 2、細(xì)胞增殖實驗：取對數(shù)生長的Hela、Caski細(xì)胞，制成濃度為4.5×10<'4>個/ml的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，置于37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，棄上清，加入含藥培養(yǎng)基，按以下三種方式加藥(1)不同

4、濃度TRAIL蛋白(10、20、50、100、200ng/ml)或順鉑(0.5、1.0、2.0mg/L)，分別檢測TRAIL和順鉑單獨用藥24小時、48小時對細(xì)胞的生長抑制作用；(2)100ng/ml的TRAIL蛋白和1.0mg/L順鉑共同作用24h，比較單獨用藥和聯(lián)合用藥作用的差異；(3)100ng/ml的TRAIL蛋白和1.0mg/L順鉑序貫應(yīng)用，即TRAIL或順鉑單獨作用12h后，再序貫順鉑或TRAIL繼續(xù)培養(yǎng)12小時，比較兩種用

5、藥方式對細(xì)胞生長的抑制作用。每一濃度均設(shè)6個平行孔，同時設(shè)空白對照孔(只加培養(yǎng)基)，加藥培養(yǎng)上述時間后，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4小時。吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜100μl，振蕩器上振蕩10min，用酶標(biāo)光度儀在波長為490nm時測定每孔的吸光度(A)值。每個實驗均重復(fù)3次取均值。 3、流式細(xì)胞儀檢測Hela、Caski細(xì)胞TRAIL受體DR4、DR5、DcR1、DcR2的表達(dá)以及

6、順鉑作用后對表達(dá)的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞以4.5×10<'4>/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)，待每瓶細(xì)胞生長至80-90％時，設(shè)對照組(僅加培養(yǎng)基)和加藥組(加入含1.0mg/L順鉑的含藥培基)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細(xì)胞，上樣流式細(xì)胞儀檢測TRAIL受體的表達(dá)。以檢測樣品熒光指數(shù)(FI)表示。實驗重復(fù)三次取平均值計算順鉑處理前后細(xì)胞TRAIL受體表達(dá)的FI值。 4、RT-PCR．方法檢測順鉑處理前后Hela、Cas

7、ki細(xì)胞株DR4、DR5、DcR1、DcR2的表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞以4.5×10<'4>/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)，待每瓶細(xì)胞生長至80-90％時，設(shè)對照組(僅加培養(yǎng)基)和加藥組(含1.0mg/L順鉑的含藥培基)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時后，收集細(xì)胞按步驟進(jìn)行RNA的提取，cDNA的反轉(zhuǎn)錄以及PCR的擴(kuò)增。以DR4,DR5,DcR1，DcR2與內(nèi)參照基因β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值，表示目的基因的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)三

8、次，取平均值。 5、統(tǒng)計學(xué)方法：計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩個樣本均數(shù)的比較用t檢驗；三組及以上資料的比較，首先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊者用多組計量資料的方差分析進(jìn)行比較，如有意義則采用q檢驗兩兩比較，p<0.05差異具有顯著性意義。所有計算均用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、Hela、Caski細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡觀察：對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞伸展，呈不規(guī)則多角形。加藥

9、培養(yǎng)24h時細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞明顯皺縮，體積變小，細(xì)胞間隙增大，有凋亡小體形成。 2、TRAIL和順鉑對Hela、Caski腫瘤細(xì)胞生長影響：用不同濃度的TRAIL和順鉑處理人宮頸癌Hela、Caski細(xì)胞24h、48h后，表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞生長抑制作用，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高。各組抑制率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3、順鉑和TRAIL蛋白聯(lián)合后較單獨用藥對細(xì)胞的生長抑制作用增強(qiáng)

10、，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。聯(lián)合用藥后對Hela細(xì)胞的生長抑制率由單用TRAIL的13.34％增加到69.44％，對Caski細(xì)胞的抑制作用由單用TRAIL的35.44％增加到89.66％。 4、順鉑序貫TRAIL的方式較TRAIL序貫順鉑的加藥方式對細(xì)胞生長的抑制作用有明顯不同，前者加藥方式對Hela和Caski細(xì)胞的生長抑制率分別為60.75％和79.88％，而后者加藥方式分別為35.22％和55.73％，實驗

11、組之間兩兩比較差異顯著，(P<0.01)。 5、Hela和Caski細(xì)胞四種TRAIL受體均有表達(dá)，但表達(dá)的豐度有所不同。其中DR4,DR5表達(dá)的FI值明顯高于DcR1，DcR2，Hela和Caski兩種細(xì)胞之間表達(dá)比較沒有差異。順鉑作用24小時后DR4和DR5表達(dá)被明顯上調(diào)，Hela細(xì)胞DR4的FI值由用藥前的1.80升高到2.20，DR5由用藥前的1.82升高到2.44；Caski細(xì)胞DR4由用藥前2.07的升高到2.35，

12、DR5由用藥前的2.14升高到2.55。實驗組與對照組比較P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。但兩種細(xì)胞的DcR1和DcR2表達(dá)較用藥前后均無統(tǒng)計學(xué)變化。 6、RT-PCR方法檢測到順鉑處理Hela和Caski細(xì)胞8h后DR4、DR5表達(dá)水平明顯升高，DR4分別為對照組的1.25倍和1.40倍，DR5為對照組的1.36倍和1.57倍，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。DcR1，DcR2表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論