紫金牛屬植物中間苯二酚衍生物的抗腫瘤活性研究.pdf

1、紫金?？谱辖鹋?Ardisia)，全株及根供藥用，為我國民間常用的中草藥，也是常見的花卉。其中大葉紫金牛(Ardisia gigantifolia Stapf)的根或者全株，是瑤醫(yī)的常用藥材，以根葉或全株入藥，可治跌打損傷、風(fēng)濕筋骨疼痛、產(chǎn)后瘀血、癰疽潰瘍、痛經(jīng)等癥，對小兒麻痹后遺癥、半身不遂有良效；矮莖紫金牛為紫金?？浦参锵冱c(diǎn)紫金牛Ardisa punctalindl(亦稱山血丹，金邊羅傘、九管血)的根莖，藥理研究表明具有止咳平喘、

2、抗炎抑菌、抗腫瘤、驅(qū)蟲殺菌等作用。本論文主要研究了紫金牛屬植物中化學(xué)成分的抗腫瘤、抗氧化活性，并對紫金牛屬植物化學(xué)成分中間苯二酚衍生物的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了體外分子藥理學(xué)和體內(nèi)基礎(chǔ)藥理學(xué)的較深入研究，為發(fā)現(xiàn)更多新的活性成分，闡明紫金牛屬植物的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 應(yīng)用MTT 法對從大葉紫金牛和矮莖紫金牛中分離鑒定得到的18個(gè)單體化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，通過DPPH 法測定其抗氧化活性；通過Hoec

3、hst 33258熒光染色法，caspase 酶活力測定法，免疫印跡western blotting 法，對從矮莖紫金牛中分離鑒定的單體化合物AB-E-2-3-1進(jìn)行體外引起腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究；并通過荷瘤裸鼠抑瘤率實(shí)驗(yàn)，對單體化合物AB-E-2-3-1進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)的初步研究。MTT 易被水溶解和透過細(xì)胞膜，可被活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶。結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，活細(xì)胞越多，與

4、MTT 形成的甲瓚結(jié)晶越多，藍(lán)紫色越深，吸光度(A)值越大，因此吸光度(A)值的大小可反映活細(xì)胞的數(shù)量；DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其溶液具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量的關(guān)系，因而可用分光法進(jìn)行定量分析；Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258 染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒

5、光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測，也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA 染色，在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染；Caspase (Cysteine-requiring AspartateProtease)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3 也稱Yama、apopain 或 CPP32，有時(shí)被寫作caspase3 或caspase

6、-3，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)很關(guān)鍵的酶。Caspase-3 可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase 底物，包括PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)，ICAD(Inhibitor of caspase-activated deoxyribo-nuclease)，gelsolin和fodrin

7、等。Caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究最多的一個(gè)caspase。這些由caspase-3 介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。另外，caspase-3在細(xì)胞核凋亡過程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮(chromatincondensention），凋亡小體形成(The formation of apoptotic bodies)，DNA 片段化(DNAfragmentation)等。同時(shí)caspase-3對細(xì)胞起泡(C

8、ell blebbing）也起到關(guān)鍵作用；免疫印跡western blotting 法是利用抗原抗體的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠)電泳分離開來，然后再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體(NC 硝酸纖維素膜或PVDF 膜)上，也就是轉(zhuǎn)膜，然后再加一抗和二抗之后，形成抗原抗體復(fù)合物，利用ECL Plus 發(fā)光試劑或其它的顯色原理將結(jié)果顯示到膜或底片上。
　　 從大葉紫金牛中分離鑒定的

9、單體化合物L(fēng)HZ-5、LHZ-6、LHZ-9對6種腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)明顯的抑制活性；LHZ-7、LHZ-8 除了對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制活性較弱之外，對其他腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性均較好；LHZ-1、LHZ-2、LHZ-3、LHZ-4、WZ-1無明顯的抗腫瘤活性。從矮莖紫金牛中分離鑒定的單體化合物AB-E-2-3-1對人肺癌A549，人胰腺癌PANC-1，人肝癌SMMC-7721等多種腫瘤細(xì)胞增殖均表現(xiàn)顯著的抑制活性。DPPH

10、 自由基清除活性測試結(jié)果表明，大葉紫金牛和矮莖紫金牛中分離所得單體化合物均無明顯的抗氧化活性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，LHZ-5、LHZ-6、AB-E-2-3-1對多種腫瘤細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)明顯的抑制作用；Hoechst 33258 熒光染色實(shí)驗(yàn)，caspase-3和caspase-9 酶活力水平檢測實(shí)驗(yàn)，免疫印跡western blotting 實(shí)驗(yàn)表明從矮莖紫金牛中分離鑒定的單體化合物AB-E-2-3-1可誘導(dǎo)人胰腺癌PANC-