HIV自然感染與疫苗誘導產生抗體的快速鑒別診斷試劑盒研制.pdf

1、目前所有候選的人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗均含有多種HIV病毒基因或基因產物并刺激機體產生相應抗體,這些抗體與HIV自然感染產生的抗體幾乎沒有差異,用目前HIV血清診斷試劑盒診斷為陽性,導致誤診。疫苗所致的假陽性結果不僅給疫苗受試者帶來社會經濟利益上的損失,精神上的傷害,也妨礙了HIV疫苗研究的發(fā)展。另外,由于治療性疫苗的應用,可使部分疫苗接種者血清病毒載量下降,HIV核酸檢測呈假陰性結果,這一結果可能威脅血制品的安全。Khurana

2、等用HIV陽性血清與HIV噬菌體展示文庫反應,篩選到能區(qū)分HIV自然感染產生抗體和注射疫苗產生抗體的三條特異性HIV抗原肽。本研究擬采用基因重組和化學合成方式得到這三條特異性肽段,并比較兩種方式產生肽段的特異性和靈敏度,用特異性和靈敏度皆優(yōu)的肽段制備HIV膠體金快速層析聯(lián)檢試劑盒,該試劑盒不僅可以用于HIV的快速檢測并能同時特異區(qū)分疫苗產生的抗體。
　　 本課題成功構建了HIV抗原肽(sk1、sk2、sk3及三短肽串聯(lián)融合肽)原

3、核表達載體,誘導表達產物通過免疫印跡檢測顯示具有生物學活性,產物通過親和層析純化獲得純度較高的融合抗原肽。但純化后的抗原肽容易降解,應用于試劑盒研制效果不理想?；瘜W合成多肽(sk1、sk2及sk3)通過斑點印跡和ELISA檢測顯示具有較好的靈敏度和特異性,適用于HIV鑒別診斷試劑盒的研制?；贖IV抗原肽研制的膠體金快速層析試劑盒表現(xiàn)出了很好的檢測靈敏度(92％)和特異性(100%),即這三條多肽能與HIV-1陽性血清反應,而與HIV陰

4、性血清及疫苗誘導血清不發(fā)生反應。這一檢測結果和基于同樣材料制備的ELISA檢測試劑盒一致(P＞0.05)。當三短肽聯(lián)合重組HIV包膜蛋白gp41和gp36后,試劑盒檢測靈敏度可達100%。
　　 本課題最終成功研制了HIV膠體金快速層析檢測試劑盒,該劑盒不僅可以檢出HIV感染,同時還可以鑒別診斷HIV疫苗誘導產生的抗體,這為疫苗臨床試驗以及HIV感染篩查提供了新的檢測工具。
　　 第一部分原核表達以及化學合成HIV-1抗

5、原肽的生物學活性研究
　　 目的:獲得特異性和靈敏度皆優(yōu)的HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3,為研制區(qū)分HIV自然感染產生抗體和疫苗誘導產生抗體的鑒別診斷試劑盒奠定材料基礎。
　　 方法:1.原核表達:用PCR及重疊延伸PCR方法從HIV-1 B亞型質粒擴增得到sk1,sk2,sk3基因序列及三段基因片段的6種連接序列;并分別克隆入原核表達載體pET32a(+)與pGEX4T-2;重組體經IPTG誘導以與His或GS

6、T標簽融合方式表達抗原肽,并經Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B層析柱親和純化;SDS-PAGE檢測融合肽表達情況,Western blot分析融合肽的抗原性;利用融合肽制備ELISA試劑盒,分析臨床樣本。2.化學合成:用化學合成的方法得到HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3;斑點印跡方法分析化學合成多肽的抗原性;利用化學合成多肽制備ELISA檢測試劑盒,分析臨床樣本。
　　 結果:1.原核表達:重組肽His-s

7、k1,His-sk123,His-sk213,His-sk231以及GST-sk3,GST-sk123,GST-sk213分別在pET32a(+)與pGEX4T-2表達載體中以上清表達形式正確表達;免疫印跡顯示上述7種融合抗原肽均能夠和HIV-1陽性血清反應而不能與HIV DNA-天壇疫苗免疫血清反應;ELISA檢測顯示,重組肽檢測靈敏度小于50%,特異度小于90%。2.化學合成:斑點印跡結果顯示化學合成多肽中sk1與HIV-1陽性血清

8、有很好的反應性,sk2和sk3較差;但三多肽均不和HIV陰性血清及HIV天壇疫苗誘導血清反應,顯示了良好的特異性。ELISA檢測結果顯示,三短肽聯(lián)合檢測靈敏度為92%,特異度達100%。
　　 結論:原核表達的融合多肽不適合應用于試劑盒開發(fā);化學合成多肽具有生物學活性可用于HIV自然感染與疫苗誘導產生抗體的鑒別診斷試劑盒的開發(fā)。
　　 第二部分 HIV快速鑒別診斷試劑盒研制
　　 目的:利用化學合成的多肽研制HI

9、V膠體金快速層析鑒別診試劑盒,該試劑盒不僅可以用于HIV的快速檢測并能同時特異區(qū)分疫苗產生的抗體。
　　 方法:化學合成多肽sk1、sk2及sk3聯(lián)合重組HIV包膜蛋白gp41和gp36用于HIV膠體金快速層析鑒別診斷試劑盒的研制;100份HIV-1陽性血清對其靈敏度進行評價,30份HIV天壇疫苗誘導血清、100份HIV陰性血清、44份HBV陽性血清、36份HCV陽性血清以及10份TB陽性血清對試劑盒的特異性進行評價;其結果與E