精漿細(xì)胞因子與ROS升高及精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常的相關(guān)性研究.pdf

1、不育癥的發(fā)病率在全球成升高趨勢(shì)，同時(shí)評(píng)估不育夫婦雙方，因男性因素導(dǎo)致的不育約占50％左右[1,2]。眾所周知，有許多因素與男性不育相關(guān)，如先天性疾病、外界環(huán)境以及一些不明原因的男性不育。男性精子的發(fā)生是一個(gè)有秩序的過(guò)程，損傷精子發(fā)生過(guò)程的任何環(huán)節(jié)都有可能導(dǎo)致精子質(zhì)量受損，最終導(dǎo)致不育。近年來(lái)，有研究認(rèn)為活性氧物質(zhì)（ROS）是導(dǎo)致不明原因男性不育的重要因素之一。適量的 ROS水平能參與精子的生理功能，但是高濃度的 ROS水平能損傷精子質(zhì)量

2、。當(dāng)體內(nèi)有高濃度的ROS水平時(shí)，會(huì)擾亂機(jī)體內(nèi)ROS跟抗氧化系統(tǒng)之間的平衡。因精子質(zhì)膜具有較高水平的磷脂、甾醇、飽和及不飽和脂肪酸，所以精子細(xì)胞特別容易受到高ROS攻擊而導(dǎo)致功能受損，包括使精子密度、活動(dòng)力下降,抑制精子獲能和頂體反應(yīng),還可使精子 DNA發(fā)生氧化損傷而導(dǎo)致不育。
　　精子染色質(zhì)是父方遺傳信息的載體，是精子結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,精子在睪丸發(fā)生過(guò)程中，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞內(nèi)富含賴氨酸的組蛋白逐漸向精子階段富含精氨酸和胱

3、氨酸的魚(yú)精蛋白轉(zhuǎn)換。魚(yú)精蛋白的半胱氨酸能在分子內(nèi)外形成二硫鍵交聯(lián)，能夠維持精子 DNA染色質(zhì)的致密狀態(tài)和穩(wěn)定性，中和DNA電荷，抑制RNA的合成，也即抑制了基因的表達(dá)。因此，精子組蛋白轉(zhuǎn)化缺陷或異常均可引起男性不育或胚胎夭折流產(chǎn)。
　　此外，有研究認(rèn)為體內(nèi)ROS與體內(nèi)的細(xì)胞因子具有復(fù)雜的相互調(diào)控作用。ROS可以促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)和生成,而一些細(xì)胞因子又以 ROS作為細(xì)胞內(nèi)信使發(fā)揮作用。在男性不育患者中，ROS異常升高地比例可達(dá)

4、15-40%，由此誘發(fā)的相關(guān)免疫細(xì)胞因子可能在生精障礙中起著重要作用。因此，研究精漿細(xì)胞因子與ROS升高及精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常對(duì)臨床的診斷、干預(yù)和治療有著重要的科學(xué)意義。
　　目的:
　　通過(guò)用苯胺藍(lán)染色法、蛋白質(zhì)芯片及液態(tài)芯片等實(shí)驗(yàn)分析精液常規(guī)、精子組蛋白轉(zhuǎn)換、細(xì)胞因子在不同ROS水平下的相互影響。研究男性不育癥患者精漿細(xì)胞因子、ROS升高及精子組蛋白轉(zhuǎn)換三者間的相關(guān)性。探究精漿細(xì)胞因子、ROS升高及精子組蛋白轉(zhuǎn)換在男性不育

5、診斷和治療的臨床意義
　　方法:
　　1、標(biāo)本的采集：選取2014年3月至2015年6月在廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院進(jìn)行精液常規(guī)檢測(cè)的不育男性。
　　2、檢測(cè)精漿ROS（6560例），找到不明原因的高ROS的病例組及對(duì)照組（224例）
　　3、對(duì)對(duì)照組及病例組的人群作臨床指標(biāo)分析，包括精子畸形率及精子組蛋白轉(zhuǎn)換率
　　4、通過(guò)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（對(duì)照組及病例組），篩選出精漿細(xì)胞因子
　　5、Bio-Plex

6、懸液芯片技術(shù)確定不育男性精漿ROS升高的精漿細(xì)胞因子標(biāo)記物
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1、根據(jù)檢測(cè)的 ROS高低值將精液樣本分為病例組及對(duì)照組，兩組人群的平均年齡、抽煙年限及抽煙頻率都是一致的，但是兩組樣本的精液質(zhì)量參數(shù)分析結(jié)果卻有顯著性的差異。高ROS水平的病例組其精子濃度、精子存活率以及精子活動(dòng)力都要明顯低于對(duì)照組，而精子畸形率卻明顯高于對(duì)照組；此外，病例組的精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常率也明顯高于對(duì)照組。

7、　　2、統(tǒng)計(jì)224例樣本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ROS水平的高低與精液質(zhì)量參數(shù)有明顯的相關(guān)性，與精子濃度、精子存活率、精子總前向運(yùn)動(dòng)率成負(fù)相關(guān)而與精子靜止運(yùn)動(dòng)率及精子畸形率成正相關(guān)。此外，數(shù)據(jù)顯示高ROS水平明確與精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常率相關(guān)。
　　3、用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選細(xì)胞因子及其受體，根據(jù)信號(hào)值高于200及倍數(shù)變化（病例組/對(duì)照組）大于2或者小于0.5，在精液樣本中篩選出93個(gè)細(xì)胞因子有顯著性改變。
　　4、從篩選出的細(xì)胞因子中挑選出1

8、8種細(xì)胞因子（CXCL5, CXCL6, CXCL8, IL16, CCL8, CCL7, CCL22, CCL20, CCL19, CXCL16, IL1B, IL6, IL7, IL10, CSF3, CCL3, CCL4, TNF-α.）用液態(tài)芯片進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)大部分的細(xì)胞因子在病例組中都有顯著性的增高；而與對(duì)照組相比病例組中細(xì)胞因子 CXCL6, CCL7, CCL22,和 CCL19卻沒(méi)有明顯的改變。此外，為了進(jìn)一步區(qū)分細(xì)胞因

9、子與ROS水平及精子質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系，將病例組分為兩個(gè)亞組即病例組1和病例組2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL16在病例組1及病例組2中有顯著差異。
　　5、研究細(xì)胞因子、ROS以及精液質(zhì)量參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)精漿細(xì)胞因子 CCL3, CXCL5, CXCL8, CSF3, IL10, IL1B, TNF-α(P<0.01)及 IL6(P<0.05)與組蛋白的轉(zhuǎn)換異常率有顯著相關(guān)性；精子濃度與細(xì)胞因子IL6呈負(fù)相關(guān)；精子活動(dòng)力與細(xì)胞因子 CXCL5

10、, CXCL8, IL1b, IL6,IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL16, CCL20(P<0.01)及 CCL8(P<0.05)呈負(fù)相關(guān)；同樣，精子前向運(yùn)動(dòng)率與細(xì)胞因子CXCL5, CXCL8, IL1b, IL6, IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL16, CCL20(P<0.01)及 CCL8(P<0.05)也呈負(fù)相關(guān)。此外，ROS值與細(xì)胞因子CSCL5, CXCL8, IL1b, IL

11、6, IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL7, IL16, CCL20(P<0.01)及CCL8(P<0.05)有明確的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1、高濃度ROS水平與精子質(zhì)量參數(shù)有明顯的相關(guān)性，能使精子濃度，精子活動(dòng)力以及存活率下降,同時(shí)也會(huì)增加精子靜止運(yùn)動(dòng)率及精子畸形率。
　　2、高濃度ROS水平與精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常率的增高有明顯的相關(guān)性。
　　3、精漿細(xì)胞因子CSCL5, CXCL8, I

12、L1b, IL6, IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL7, IL16, CCL20及CCL8與ROS水平有明顯相關(guān)性，細(xì)胞因子 CXCL5, CXCL8, IL1b, IL6,IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL16, CCL20及CCL8與精子存活率呈負(fù)相關(guān)，同樣，精子前向運(yùn)動(dòng)率與細(xì)胞因子CXCL5, CXCL8, IL1b, IL6, IL10, TNF-α, CSF3, CCL3, IL16,