活性維生素D3對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞nephrin、podocin、WT1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:本課題通過建立腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病SpragueDawley(SD)大鼠模型,應(yīng)用活性維生素D3干預(yù)糖尿病大鼠,采用免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄PCR、光鏡等方法檢測(cè)SD大鼠腎組織,觀察活性維生素D3對(duì)其足細(xì)胞nephrin、podocin及WT1表達(dá)的影響,探討活性維生素D3是否可以改善糖尿病大鼠足細(xì)胞的濾過功能,從而減少蛋白尿、延緩腎臟病的進(jìn)展,為糖尿病腎病的早期防治,提供實(shí)驗(yàn)性理論依

2、據(jù)。
　　 Nephrin是足細(xì)胞上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員,特異表達(dá)在足細(xì)胞上,nephrin可誘導(dǎo)Akt途徑使數(shù)種靶蛋白磷酸化,保護(hù)及減少足細(xì)胞凋亡。Podocin通過CD-2AP連接于Nephrin形成復(fù)合體,呈發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜內(nèi),其對(duì)Nephrin信號(hào)傳導(dǎo)有增強(qiáng)作用。他們表達(dá)異常可影響腎小球?yàn)V過屏障通透性,導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。故兩者對(duì)維持腎小球?yàn)V過屏障及足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)完整性發(fā)揮著極其重要的作用

3、。腎母細(xì)胞瘤抑制基因(WT1)對(duì)多種基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,是足細(xì)胞的特異標(biāo)志之一,對(duì)維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能有重要作用。
　　 方法:選擇清潔級(jí)SD(雄性)大鼠36只,體重200±20g,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,隨機(jī)選取24只大鼠給予鏈脲佐菌素腹腔注射制備糖尿病模型,其余12只做正常對(duì)照組(NC組)。將造模成功的大鼠按隨機(jī)區(qū)組原則分為:糖尿病對(duì)照組(DN組)、活性維生素D3治療組(DT組),每組各12只。DT組在糖尿病模型建立之后予骨

4、化三醇0.03ug/(kg·d)灌胃;NC及DN組以等量的花生油灌胃。分別于模型成功后8、12周測(cè)定各組大鼠血鈣、血磷、血肌酐、血尿素氮以及24小時(shí)蛋白尿,并收集腎組織標(biāo)本。用蘇木素伊紅(HE)在光鏡下觀察大鼠腎組織病理變化;采用免疫組織化學(xué)方法及RT-PCR檢測(cè)腎臟nephrin、podocin及WT1的表達(dá)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,各組間比較采用單因素方差分析(滿足正態(tài)性和方差齊性),兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本

5、t檢驗(yàn)(不滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理,以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1一般情況DN組、DT組大鼠注射STZ后2～4天即出現(xiàn)多飲、多食、多尿,逐漸消瘦,活動(dòng)減少,而NC組則無(wú)上述情況出現(xiàn)。
　　 2生化檢測(cè)結(jié)果各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、血鈣、血磷、血肌酐及尿素氮的比較。8及12周末DN組大鼠尿蛋白定量、血肌酐與NC組比較,DN組升高明顯(P

6、＜0.05),DT組比DN組低(P＜0.05)。血鈣8周時(shí)DN較NC組降低,12周時(shí)降低更明顯;DT組在8周時(shí)與DN組比較差別不大,12周時(shí)血鈣水平較DN組高,但低于NC組。血磷水平同期各組間比較無(wú)差別(P＞0.05)。
　　 3組織化學(xué)變化蘇木精——伊紅染色(HE)結(jié)果光鏡HE染色顯示,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中NC組大鼠的腎臟組織均未見明顯病理學(xué)改變。與同期的NC組相比,12周末,DN組腎小球體積增大,腎小球系膜區(qū)增寬,系膜細(xì)胞增多。腎

7、間質(zhì)、腎小管無(wú)明顯病理形態(tài)學(xué)改變。同期DT組腎小球病變不明顯。
　　 4免疫組織化學(xué)結(jié)果8周和12周末DN組、DT組與NC組比較大鼠腎組織中nephrin、podocin及WT1的表達(dá)減少,其中12周末降低更為顯著(P＜0.05);8周和12周末DT組較DN組各因子表達(dá)升高,但低于同期NC組(P＜0.05)。
　　 5ReverseTranscription-PCR(RT-PCR)結(jié)果與NC組大鼠相比,糖尿病大鼠腎組織中

8、nephrin、podocin及WT1表達(dá)降低,12周末變化更顯著(P＜0.05);8周和12周末DT組較DN組各因子表達(dá)升高,但低于同期NC組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1糖尿病大鼠腎組織nephrin、podocin及WT1表達(dá)下降,與蛋白尿水平呈負(fù)相關(guān),提示nephrin、podocin及WT1在糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。
　　 2活性維生素D3能夠明顯減輕糖尿病大鼠蛋白尿的產(chǎn)生及腎臟病理形態(tài)學(xué)