Sj31-32kD天然分子疫苗編碼基因的鑒定及其特異性單鏈抗體的篩選.pdf

1、業(yè)已證明，日本血吸蟲31/32kDa天然分子抗原，不僅是一種優(yōu)勢(shì)診斷抗原，可用于免疫診斷，同時(shí)也具有較好的抗雌蟲生殖免疫的效果。為了對(duì)Sj31/32kDa分子抗原進(jìn)一步深入分析，采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，建立了日本血吸蟲成蟲可溶性抗原二維電泳圖譜。對(duì)Sj31/32kDa附近的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行肽指紋圖譜、質(zhì)譜分析，在Sj31/32kDa附近獲得了3個(gè)同源性較高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(11，20，23號(hào))，分別與日本血吸蟲-3-磷酸甘油脫氫酶、曼氏血吸蟲

2、組織蛋白酶B內(nèi)肽酶、曼氏血吸蟲肌動(dòng)蛋白-2(Actine-2)相匹配。有報(bào)道表明，血吸蟲組織蛋白酶B內(nèi)肽酶參與對(duì)宿主血紅蛋白的降解，與血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，具有潛在的血吸蟲病疫苗價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)對(duì)該基因研究的相關(guān)報(bào)道。 研究目的：確定日本血吸蟲組織蛋白酶B內(nèi)肽酶(SjCB)是否能作為抗血吸蟲病天然分子基因疫苗的靶標(biāo)，及其在血吸蟲體內(nèi)是否有期特異性，獲得針對(duì)日本血吸蟲組織蛋白酶B內(nèi)肽酶的特異性單鏈抗體，為抗血吸蟲病天然分子候

3、選疫苗編碼基因的篩選及重組優(yōu)勢(shì)抗原診斷血吸蟲病的研究奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸蟲成蟲，制備成蟲可溶性蛋白，經(jīng)一維電泳、固相pH梯度雙向凝膠電泳分離，選取31/2kDa附近的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，凝膠圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理。 2.以血吸蟲cDNA文庫(kù)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到目的基因，亞克隆至pcDNA3.0載體；以成蟲和尾蚴真核重組質(zhì)粒分別免疫小鼠，觀察其免疫保護(hù)性效果。

4、 3.將目的基因亞克隆至pQE30載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌M15，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag標(biāo)簽柱親和純化融合蛋白。 4.用日本血吸蟲成蟲可溶性抗原(AWA)免疫BALB/C小鼠，提取小鼠脾臟RNA，RT-PCR法擴(kuò)增得到全套VH和VL基因，經(jīng)重疊PCR法擴(kuò)增得到scFv片段，將scFv片段克隆至pCANTAB5E載體，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TG1

5、，經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救，即獲得日本血吸蟲成蟲可溶性抗原表面呈現(xiàn)單鏈抗體庫(kù)。以純化的目的融合蛋白為靶抗原，分別篩選成蟲可溶性抗原單鏈抗體庫(kù)和UV-致弱尾蚴單鏈抗體庫(kù)，以獲得相應(yīng)的特異性單鏈抗體。 研究結(jié)果： 1.二維電泳結(jié)果顯示Sj31/32kDa附近有13個(gè)蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定及分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白分子分別與曼氏血吸蟲Actine-2，日本血吸蟲3磷酸甘油脫氫酶，曼氏血吸蟲組織蛋白酶B內(nèi)肽酶有高度

6、的同源性。 2.真核重組質(zhì)粒成蟲pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功構(gòu)建，限制性雙酶切、PCR鑒定及核苷酸測(cè)序結(jié)果顯示二者基因序列具有99％的同源性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組質(zhì)粒成蟲pcDNA3.0/SjCB免疫組的減蟲率為38.99％，每雌減卵率為34:45，每克腸道減卵率為40.18％，每克肝臟減卵率為43.24％;重組質(zhì)粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫組的減蟲率為38.36％，每雌減卵率為41

7、.00％，每克腸道減卵率為39.30％，每克肝臟減卵率為44.87％，與對(duì)照組比較有顯著差異。而重組質(zhì)粒成蟲pcDNA3.0/SjCB組和尾蚴pcDNA3.0/SjCB組減蟲率和減卵率無(wú)顯著差異。 3.原核重組質(zhì)粒成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功構(gòu)建，限制性雙酶切、PCR鑒定及核苷酸測(cè)序結(jié)果顯示融合蛋白表達(dá)正確，并得以有效純化。分別被成蟲可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清識(shí)別，而不被正常鼠血清

8、識(shí)別。 4.構(gòu)建了日本血吸蟲成蟲可溶性抗原單鏈抗體庫(kù)，庫(kù)容為4.3X108，重組率為90％，且BstNI酶切圖譜呈多樣性，初步篩選出了針對(duì)成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表達(dá)的融合蛋白的特異性重組噬菌體。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了成蟲pcDNA3.0/ SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重組質(zhì)粒以及成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重組質(zhì)粒，成蟲及尾蚴SjCB基因序列