Sj31-32kD天然分子疫苗編碼基因的鑒定及其特異性單鏈抗體的篩選.pdf

1、業(yè)已證明，日本血吸蟲31/32kDa天然分子抗原，不僅是一種優(yōu)勢診斷抗原，可用于免疫診斷，同時也具有較好的抗雌蟲生殖免疫的效果。為了對Sj31/32kDa分子抗原進一步深入分析，采用蛋白質組學研究技術，建立了日本血吸蟲成蟲可溶性抗原二維電泳圖譜。對Sj31/32kDa附近的蛋白質斑點進行肽指紋圖譜、質譜分析，在Sj31/32kDa附近獲得了3個同源性較高的蛋白質斑點(11，20，23號)，分別與日本血吸蟲-3-磷酸甘油脫氫酶、曼氏血吸蟲

2、組織蛋白酶B內肽酶、曼氏血吸蟲肌動蛋白-2(Actine-2)相匹配。有報道表明，血吸蟲組織蛋白酶B內肽酶參與對宿主血紅蛋白的降解，與血吸蟲的生長發(fā)育有關，具有潛在的血吸蟲病疫苗價值。目前國內外尚未見對該基因研究的相關報道。 研究目的：確定日本血吸蟲組織蛋白酶B內肽酶(SjCB)是否能作為抗血吸蟲病天然分子基因疫苗的靶標，及其在血吸蟲體內是否有期特異性，獲得針對日本血吸蟲組織蛋白酶B內肽酶的特異性單鏈抗體，為抗血吸蟲病天然分子候

3、選疫苗編碼基因的篩選及重組優(yōu)勢抗原診斷血吸蟲病的研究奠定基礎。 研究方法： 1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸蟲成蟲，制備成蟲可溶性蛋白，經一維電泳、固相pH梯度雙向凝膠電泳分離，選取31/2kDa附近的蛋白點進行質譜分析鑒定，凝膠圖像分析軟件對結果進行處理。 2.以血吸蟲cDNA文庫為模板，設計引物擴增得到目的基因，亞克隆至pcDNA3.0載體；以成蟲和尾蚴真核重組質粒分別免疫小鼠，觀察其免疫保護性效果。

4、 3.將目的基因亞克隆至pQE30載體，將重組質粒轉化至感受態(tài)大腸桿菌M15，IPTG誘導表達融合蛋白，并進行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag標簽柱親和純化融合蛋白。 4.用日本血吸蟲成蟲可溶性抗原(AWA)免疫BALB/C小鼠，提取小鼠脾臟RNA，RT-PCR法擴增得到全套VH和VL基因，經重疊PCR法擴增得到scFv片段，將scFv片段克隆至pCANTAB5E載體，電轉化至感受態(tài)大腸桿菌TG1

5、，經輔助噬菌體M13K07拯救，即獲得日本血吸蟲成蟲可溶性抗原表面呈現單鏈抗體庫。以純化的目的融合蛋白為靶抗原，分別篩選成蟲可溶性抗原單鏈抗體庫和UV-致弱尾蚴單鏈抗體庫，以獲得相應的特異性單鏈抗體。 研究結果： 1.二維電泳結果顯示Sj31/32kDa附近有13個蛋白點，經MALDI-TOF-MS鑒定及分析，發(fā)現3個蛋白分子分別與曼氏血吸蟲Actine-2，日本血吸蟲3磷酸甘油脫氫酶，曼氏血吸蟲組織蛋白酶B內肽酶有高度

6、的同源性。 2.真核重組質粒成蟲pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功構建，限制性雙酶切、PCR鑒定及核苷酸測序結果顯示二者基因序列具有99％的同源性;動物實驗結果表明重組質粒成蟲pcDNA3.0/SjCB免疫組的減蟲率為38.99％，每雌減卵率為34:45，每克腸道減卵率為40.18％，每克肝臟減卵率為43.24％;重組質粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫組的減蟲率為38.36％，每雌減卵率為41

7、.00％，每克腸道減卵率為39.30％，每克肝臟減卵率為44.87％，與對照組比較有顯著差異。而重組質粒成蟲pcDNA3.0/SjCB組和尾蚴pcDNA3.0/SjCB組減蟲率和減卵率無顯著差異。 3.原核重組質粒成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功構建，限制性雙酶切、PCR鑒定及核苷酸測序結果顯示融合蛋白表達正確，并得以有效純化。分別被成蟲可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清識別，而不被正常鼠血清

8、識別。 4.構建了日本血吸蟲成蟲可溶性抗原單鏈抗體庫，庫容為4.3X108，重組率為90％，且BstNI酶切圖譜呈多樣性，初步篩選出了針對成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表達的融合蛋白的特異性重組噬菌體。 結論： 1.成功構建了成蟲pcDNA3.0/ SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重組質粒以及成蟲pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重組質粒，成蟲及尾蚴SjCB基因序列