人黑素瘤單鏈抗體-量子點(diǎn)納米探針的制備及其特異性結(jié)合黑素瘤細(xì)胞.pdf

1、研究背景:
　　 黑素瘤又名惡性黑素瘤(Malignant melanoma,MEL),主要起源于表皮的黑色素細(xì)胞,是惡性程度極高的一種皮膚腫瘤,可發(fā)生于全身各個(gè)部位,但多見于皮膚,發(fā)病機(jī)理尚未明確,侵襲力強(qiáng),一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移可以迅速地?cái)U(kuò)散到全身,死亡率很高,與一般皮膚腫瘤的治療方案不同,目前對(duì)于轉(zhuǎn)移性黑素瘤尚無有效的治療方法。
　　 但是早期黑素瘤若治療及時(shí)是可以痊愈的,因此近年來通過抗體等生物小分子對(duì)細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)進(jìn)

2、行靶向定位的分子影像,成為了研究黑素瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn),為腫瘤的早期診斷和治療帶來了希望。
　　 抗黑素瘤相關(guān)抗原的抗體可作為探針用于黑素瘤的診斷和治療。至今為止,發(fā)現(xiàn)的黑素瘤相關(guān)抗原有很多,其中神經(jīng)節(jié)苷脂和高分子量相關(guān)抗原的研究較多。本研究所采用的是抗人黑素瘤神經(jīng)節(jié)苷脂單鏈抗體(anti-human melanomagaglioside single chain variable fragment antibody,GD/S

3、cFvMEL),ScFv是基因工程抗體中的新成員,其大小只有完整抗體的六分之一,體積優(yōu)勢(shì)使其在血液和正常組織中的清除率快且更容易滲透到腫瘤組織當(dāng)中,故在腫瘤的診斷、治療和預(yù)防中得到了極為廣泛的應(yīng)用。
　　 把ScFv與熒光染料連接上,就可以觀察該ScFv在體內(nèi)外與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的效果。量子點(diǎn)(quantum dots,QDs),尤其是水溶性、高量子產(chǎn)率的QDs是近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn),其超強(qiáng)的熒光穩(wěn)定性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)染料

4、,利用不同尺寸的QDs在單一波長光源激發(fā)下可發(fā)射出不同顏色的光,可同時(shí)觀察活細(xì)胞內(nèi)或其表面的多個(gè)靶分子,從而研究這些分子的生物特性以及它們之間的相互關(guān)系。
　　 本研究把GD/ScFvMEL基因片段與pET28a(+)以及pET32a(+)組成新的重組子,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,在此基礎(chǔ)上與QDs結(jié)合,探討以GD/ScFvMEL為新的靶向分子用于體外成像和診斷的可能性,為黑素瘤的早期檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。
　

5、　 目的:
　　 把GD/ScFvMEL基因分別克隆到pET28a(+)和pET32a(+)載體上,進(jìn)行表達(dá)純化后,將純化產(chǎn)物與碲化鎘量子點(diǎn)(CdTe quantum dots,QDs)連接,制備成GD/ScFvMEL-QDs納米探針,觀察該納米探針對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合效果。
　　 方法:
　　 1.參考天根生化科技(北京)有限公司說明書對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行小量提取。設(shè)計(jì)帶有Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶

6、切位點(diǎn)的PCR引物,參考TaKaRa公司DNA聚合酶說明書通過PCR擴(kuò)增目的基因片段,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃,5min→(94℃,30sec→55℃,30sec→72℃,1min)×35 cycle→72℃,7min。參考TaKaRa公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行DNA片段膠回收并將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接。
　　 2.把帶有目的片段的T載體與pET28a(+)同時(shí)用NdeⅠ與XhoⅠ雙酶切,載體大片段和目的基因體外連接,得到重組

7、子pET28-GD/ScFvMEL。參照天根公司DH5 α感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明書,把重組子pET28-GD/ScFvMEL轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,在含有50 μg/mL Kana的平板上篩選重組質(zhì)粒。同理,將帶有目的片段的T載體與pET32a(+)同時(shí)用EcoR Ⅰ與Xho Ⅰ雙酶切來處理,對(duì)DNA片段進(jìn)行膠回收和連接處理后得到帶有GD/ScFvMEL基因的重組子pET32-GD/ScFvMEL,轉(zhuǎn)化克隆宿主E.c

8、oli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,carben抗性的平板上篩選重組質(zhì)粒。
　　 3.對(duì)2個(gè)重組子陽性菌分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,并委托上海桑尼公司進(jìn)行序列測(cè)定。
　　 4.確認(rèn)2個(gè)重組子中的目的基因片段序列均正確后,把pET28-GD/ScFvMEL和pET32-GD/ScFvMEL在E.coli BL21(DE3)細(xì)菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。將過夜培養(yǎng)的陽性克隆菌液,以1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)

9、2～3 h后,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,誘導(dǎo)4小時(shí)。取1 ml菌液17000×g離心收集菌體,加入30 μl SDS加樣緩沖液,重懸,混勻,煮沸10 min,離心取上清,存于-20℃?zhèn)溆?。制?％的濃縮膠和15％的分離膠。取蛋白樣品20μl上樣,行SDS-PAGE電泳。
　　 5.GD/ScFvMEL表達(dá)產(chǎn)物的純化
　　 摸索使蛋白得到最大表達(dá)的條件,GD/ScFvMEL表達(dá)產(chǎn)物的純化和復(fù)性按照Qiangen

10、公司的Ni-NTA Superflow Cartridges說明書。取800 ml IPTG誘導(dǎo)后菌液,離心后加入12 ml裂解液重懸后,離心取上清注入His標(biāo)簽純化柱,用10 ml洗滌緩沖液洗滌除去非特異性蛋白后,加入10 ml沈脫緩沖液洗脫目的蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白濃度后,用稀釋液緩沖液(4mol/L尿素、0.1mol/L Tris-Cl、0.1mol/L NaH2PO4)將蛋白稀釋至0.1 mg/ml,注進(jìn)透析袋中,在復(fù)

11、性緩沖液Ⅰ(2mol/L尿素、0.1mol/L Tris-Cl,0.1mol/L NaH2PO4、0.9mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽、0.4mmol/L CuSO4、0.1mol/L EDTA、0.5mol/L L-精氨酸)中4℃透析12 h,換成復(fù)性緩沖液Ⅱ(1mol/L尿素、0.1mol/L Tris-Cl、0.1mol/L NaH2PO4、0.9mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1mmol/L氧化型谷

12、胱甘肽、0.4mmol/L CuSO4、0.1mol/L EDTA、0.5mol/L L-精氨酸)中4℃透析12 h。更換為PBS,4℃繼續(xù)透析24 h。取出透析袋內(nèi)蛋白液體,用超濾管濃縮后放4℃保存。SDS-PAGE電泳分析純化過程的各組成成分。電泳結(jié)束后,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析:把PAGE膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上,5％BSA 4℃封閉過夜,加入抗His抗體(1:3000稀釋),室溫孵育1 h,用TBST洗滌3

13、次,每次10 min,再加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)(HRP)的羊抗鼠IgG二抗(1:5000稀釋)室溫孵育1h,TBST洗滌3次,加入TMB使底物顯色。
　　 6.CdTe量子點(diǎn)由崔大祥教授研究室合成并提供。制備的QDs用高分辨透射電鏡、熒光分光光度計(jì)進(jìn)行表征分析。
　　 7.純化后的蛋白分別與量子點(diǎn)連接制備成納米探針:
　　 將N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)

14、以1:1的比例混合后,加入300 μl去離子水,加入600μl制備的QDs,超聲下混合反應(yīng)5 min。加入2 mg/ml的純化的目的蛋白300μl,混勻后,在旋轉(zhuǎn)混合器上反應(yīng)2 h。采用親和層析柱純化,去除未結(jié)合的量子點(diǎn)。制備的納米探針,采用熒光分光光度計(jì)與SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
　　 8.納米探針(GD/ScFvMEL-QDs)靶向黑素瘤細(xì)胞的成像實(shí)驗(yàn)將黑素瘤A375細(xì)胞和胃癌MGC-803細(xì)胞用含10％小牛血清的DE

15、ME培養(yǎng)基,置37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后,用4％多聚甲醛固定15 min,0.1％PBS溶液洗滌3次,每次5 min,3％BSA封閉10 min,然后,分別加入20μl GD/ScFvMEL-QDs,4℃孵育過夜,次日用0.1％PBS溶液洗滌3次后,在熒光顯微鏡下觀察并記錄。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過上述實(shí)驗(yàn),獲得了人源的GD/ScFvMEL基因,并首次在pET系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)；