黃曲霉菌特異單鏈抗體及其基因的分離鑒定和應用.pdf

1、黃曲霉菌（Aspergillusflavus）是一種重要的植物病原真菌，造成玉米、花生、棉花等多種農作物的減產和糧食的霉變，導致重大的經濟損失。黃曲霉菌也是一種重要的人和動物致病菌引起嚴重的曲霉病。黃曲霉菌和寄生曲霉菌（Aspergillusparasiticus）產生的次級代謝產物黃曲霉毒素(aflatoxin)是一種劇毒的真菌毒素，具有強烈地致癌和致畸作用。被黃曲霉菌污染的農產品中通常有大量的黃曲霉毒素殘留，被人和動物誤食會導致嚴重

2、的中毒事件，長期攝入會誘發(fā)肝癌等疾病，嚴重威脅人和動物的健康。因此對黃曲霉菌進行快速、靈敏地檢測對于預防黃曲霉菌引起的動植物病害，監(jiān)測黃曲霉毒素的污染具有重要的意義。
　　免疫學檢測技術利用了抗體和抗原之間的特異性互作，已經被廣泛應用于各種病原菌的快速診斷。傳統(tǒng)的免疫學檢測方法主要利用多克隆抗體和單克隆抗體，但這2種抗體的制備依賴于動物免疫和雜交瘤細胞融合技術，生產成本較高。利用噬菌體展示技術可以從抗體文庫中篩選到高親和力單鏈抗體

3、，并且同時獲得抗體的編碼基因。單鏈抗體具有易于原核表達和基因工程改造等優(yōu)點，在免疫學檢測領域中有顯著的優(yōu)勢。本研究以黃曲霉菌細胞壁蛋白為靶標，選到了高親和力單鏈抗體，所取得的主要成果如下:
　　1.將黃曲霉細胞壁蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤細胞融合技術篩選到了4株黃曲霉菌特異單克隆抗體雜交瘤細胞。對4種從小鼠腹水中純化的單克隆抗體進行了ELISA分析，結果表明mAb2A8抗體對黃曲霉細胞壁蛋白的親和力最高，可以用于免疫學檢測。

4、　　2.將黃曲霉細胞壁蛋白免疫雞，構建了庫容量為1.2×107的雞源單鏈抗體文庫，并利用噬菌體展示技術對抗體文庫進行了篩選。通過表達ELISA從篩選后的單鏈抗體文庫中鑒定出了35個陽性克隆，對所屬的4種類型高親和力抗體AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10進行原核表達和純化。
　　3.對篩選到的單鏈抗體氨基酸序列進行分析，結果表明抗體CDR區(qū)序列的組成和長度存在較大差異。間接ELISA分析表明AfSA4對黃曲霉菌和寄生曲

5、霉菌的親和力最高。對AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10的空間結構進行了預測，結構比較分析表明AfSA4的L-CDR2和H-CDR3結構域之間存在氫鍵等緊密的相互作用，該部位獨特的致密空間結構可能與AfSA4的高親和力密切相關。免疫熒光分析表明AfSA4可以與黃曲霉和寄生曲霉細胞壁表面結合，而AfSA5、AfSA8和AfSD10不能識別細胞壁表面。免疫印跡分析也迸一步證明了不同單鏈抗體之間存在抗原識別特性的差異。
　　

6、4.利用phageELISA方法對淘選后的抗體文庫進行鑒定，對篩選到的陽性克隆序列進行了分析，并與表達ELISA的鑒定結果進行比較。從中篩選到了高親和力單鏈抗體AfPD12，并進行原核表達和純化。免疫熒光實驗證明AfPD12識別黃曲霉和寄生曲霉細胞壁表面抗原。免疫印跡實驗證明AfPD12識別細胞壁蛋白。
　　5.將AfSA4和AfPD12與堿性磷酸酶(AP)構建成融合蛋白AfSA4-AP和AfPD12-AP，并進行原核表達和純化。

7、ELISA和免疫印跡分析表明scFv抗體和scFv-AP融合蛋白具有相同抗原識別特性，特異性識別曲霉屬病原真菌。表面等離子共振(SPR)分析表明AfSA4-AP親和力比AfSA4提高了約6倍，AfPD12-AP親和力比AfPD12提高了約14倍。間接ELISA實驗表明scFv-AP融合蛋白檢測抗原的靈敏度更高。
　　6.將AfPD12與生物素化標簽蛋白構建了Bio-AfPD12融合蛋白，并進行原核表達和純化。Westernblot

8、分析表明鏈霉親和素特異性識別原核表達的Bio-AfPD12證明Bio-AfPD12被成功生物素化。間接ELISA實驗表明Bio-AfPD12能夠用于檢測黃曲霉菌和寄生曲霉菌。
　　7.利用包被抗體mAb2A8和檢測抗體AfSA4-AP建立了夾心ELISA(ds-ELISA)檢測體系，可以同時對黃曲霉菌和寄生曲霉菌進行高靈敏度檢測，對兩者的最低檢測限達到10-3μg/mL。在玉米和花生基質中對兩種真菌檢測的靈敏度達到1μg/g。該檢

9、測方法對健康的玉米、花生材料和非曲霉屬的常見植物病原真菌沒有交叉反應，可以用于對黃曲霉毒素產生菌的免疫學檢測。
　　8.利用包被抗體AfPD12和檢測抗體AfPD12-AP建立的ds-ELISA可以檢測黃曲霉菌和寄生曲霉菌，靈敏度達到10-2μg/mL，該方法可以避免對單克隆抗體的使用。利用AfPD12和Bio-AfPD12建立了夾心熒光免疫吸附(ds-FLISA)檢測方法，對黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測靈敏度為10-1μg/mL。