柄區(qū)肽和腎素(前體)受體干擾對(duì)腎素前體激活的P13K-AKT信號(hào)通路的影響.pdf

1、背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是嚴(yán)重影響人類的健康的主要疾病。其機(jī)理的研究已進(jìn)行了數(shù)十年。目前一致認(rèn)為，炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能紊亂對(duì)AS的形成和發(fā)展起著關(guān)鍵作用。許多危險(xiǎn)因素可激活一些信號(hào)通道蛋白和炎癥因子，導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常。其中腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的效應(yīng)因子血管緊張素Ⅱ(Ang H)在動(dòng)脈粥樣硬化中起著重要作用。過去認(rèn)為，腎素發(fā)揮酶活性使血管緊張素原轉(zhuǎn)變成Ⅰ(AngⅠ)，除此之外無其他生物學(xué)效應(yīng)。腎素前體則被視為無活性

2、的腎素的前體。近年來，隨著腎素（前體）受體[(pro)renin receptor，(P)RR]的發(fā)現(xiàn)，對(duì)腎素前體的功能有了再認(rèn)識(shí)。一些研究表明，腎素和腎素前體通過與(P)RR結(jié)合，可發(fā)揮不依賴于AngⅡ的生物學(xué)作用，使腎系膜細(xì)胞增殖，平滑肌細(xì)胞遷移等作用。本實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)用免疫組化的方法首次發(fā)現(xiàn)(P)RR在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中也有表達(dá)。于是，我們推測腎素（前體）及其受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可能存在與腎系膜細(xì)胞及心肌細(xì)胞類似的病

3、理生理作用。
　　 腎素前體前肽，即柄區(qū)肽(handle region peptide， HRP)，是一段人工合成的含有10個(gè)氨基酸的肽片段，影響腎素前體與(P)RR的結(jié)合，因此HRP被認(rèn)為是(P)RR阻滯劑。但是目前對(duì)HRP作為(P)RR阻斷劑的研究結(jié)果存在矛盾。本實(shí)驗(yàn)將通過成倍增加HRP作用濃度，觀察HRP能否阻斷(P)RR，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)性作用。
　　 PI3K\AKT信號(hào)通路能直接磷酸化多種細(xì)胞因子，如NFκ

4、B、Bcl-2、TGF-β等，與血管壁細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移和肥大有關(guān)。因此，PI3K\AKT信號(hào)通路可能參與腎素前體及其受體的作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 觀察在離體培養(yǎng)的HUVEC中，腎素前體能否不依賴于AngⅡ并通過(P)RR來影響細(xì)胞中PI3K\AKT，NFκB蛋白以及炎癥因子IL-6的表達(dá)；并觀察HRP是否存在(P)RR阻斷功能。
　　 方法：
　　 1．體外培養(yǎng)原代HUVECs。
　

5、　 2．予奧美沙坦(10-5M)和PD123319(10-4M)分別阻斷HUVECs血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2，觀察腎素前體(2×10-9M)對(duì)細(xì)胞中PI3K，p-AKT，NFκB-P65蛋白以及細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6的影響。
　　 3．分別以(P)RR-siRNA干擾細(xì)胞(P)RR，以及三種濃度的HRP(1×10-6M，5×10-6M，10×10-6M)作用于細(xì)胞，觀察各自對(duì)腎素前體引起的AKT、NFκB-P65蛋

6、白以及IL-6激活的影響。
　　 4．予Wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K\AKT信號(hào)通路，觀察wortmannin對(duì)腎素前體引起的AKT、NFκB-P65蛋白以及IL-6激活的影響。
　　 5.(P)RR干擾效率通過RT-PCR檢測。
　　 6.PI3K，p-AKT，p65蛋白通過western-blot檢測。
　　 7．細(xì)胞上清液中IL-6的濃度用ELISA試劑盒檢測。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1．腎素前體可以上調(diào)PI3K，P-AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6的表達(dá)。
　　 2．三種HRP濃度均不能抑制腎素前體引起的AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6激活。
　　 3.(P)RR干擾可以抑制腎素前體引起的AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6激活。
　　 4．腎素前體引起的P65和IL-6表達(dá)增加不能被wortmannin所抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1．腎素