人TREM-1原核表達(dá)載體構(gòu)建和多克隆抗體制備及急性肺部感染患者可溶性TREM-1檢測(cè).pdf

1、[目的]
　　 TREM-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是一種在炎癥反應(yīng)的觸發(fā)及放大過程中具有重要作用的分子，選擇表達(dá)于髓樣細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)表面，可放大促炎性細(xì)胞因子的釋放，因此它在感染性疾病，膿毒癥等發(fā)揮重要作用。感染早期TREM-1可以可溶性形式(soluble TREM-1，sTREM-1)釋放進(jìn)入體液，而且sTREM

2、-1與感染嚴(yán)重程度有較好的相關(guān)性，提示sTREM-1是一種早期診斷急性肺部感染的新指標(biāo)，為了進(jìn)一步研究人TREM-1在急性肺部感染發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建TREM-1原核表達(dá)載體，表達(dá)、純化TREM-1蛋白；進(jìn)一步制備多克隆抗體，并對(duì)多克隆抗體進(jìn)行鑒定；建立sTREM-1 ELISE檢測(cè)方法，并檢測(cè)急性肺部感染患者血清的TREM-1含量。為急性肺部感染的早期診斷及療效評(píng)價(jià)、預(yù)后估計(jì)提供新的指標(biāo)和方法。
　　 [方法]
　

3、　 1.構(gòu)建含人TREM-1胞外段目的基因的T載體克隆及原核表達(dá)載體亞克隆，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序證實(shí)后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TREM-1融合蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定，將重組基因工程菌擴(kuò)大誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化誘導(dǎo)的TREM-1融合蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏完全佐劑乳化，將其作為抗原免疫家兔，獲得兔抗人免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，獲得初步純化的兔抗人TREM-1多克隆抗體，通過雙擴(kuò)散試驗(yàn)和間接ELISE方法檢測(cè)多

4、克隆抗體的效價(jià)和純度，Western bolt對(duì)它進(jìn)行鑒定。
　　 3.用商品單抗和自制多抗建立ELISE夾心法，并對(duì)方法進(jìn)行條件優(yōu)化，測(cè)定其準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和線性范圍，方法建立后用于檢測(cè)急性肺部感染患者血清中可溶性TREM-1的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成功構(gòu)建了高表達(dá)重組人TREM-1蛋白的原核表達(dá)載體，并表達(dá)具有抗原性的TREM-1融合蛋白。
　　 2.獲得純化的TREM-1融合蛋白，

5、并用其免疫家兔，得到兔抗人TREM-1多克隆抗體。以重組蛋白為抗原，用間接ELISE檢測(cè)TREM-1抗血清的效價(jià)達(dá)到1:25600，雙向瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)顯示TREM-1多克隆抗體與抗原之間形成單一沉淀線，效價(jià)達(dá)到1:16，Western bolt分析TREM-1抗血清在分子量21.80KDa處與相應(yīng)的原核表達(dá)蛋白呈現(xiàn)特異性條帶，表明所制備的多克隆抗體效價(jià)較高，具有良好的純度。
　　 3.建立可溶性TREM-1 ELISE檢測(cè)方法

6、，并對(duì)30例急性肺部感染和30例正常體檢血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)急性肺部感染患者TREM-1含量明顯增高。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了高效表達(dá)重組人TREM-1融合蛋白的原核表達(dá)載體，獲得高效穩(wěn)定的重組基因大腸桿菌表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的TREM-1融合具有免疫原性，將其作為免疫原制備的兔抗人TREM-1多克隆抗體能與純化的外源性TREM-1融合蛋白和天然表達(dá)的內(nèi)源性TREM-1蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，檢測(cè)TREM-