龍膽苦苷多克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、龍膽苦苷（GTP）是藥用植物秦艽中的主要有效成分，也是測定其品質(zhì)的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。龍膽苦苷具有保肝利膽、鎮(zhèn)痛、健胃、降壓、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。隨著對龍膽苦苷藥理作用研究的深入，需求量不斷上升，致使野生秦艽資源保有量急劇下降，現(xiàn)已被列為國家三級瀕危保護(hù)藥材，在利益驅(qū)使下假冒偽劣秦艽藥材在市場上隨之出現(xiàn)。因此，建立一個低成本、高效率的龍膽苦苷檢測技術(shù)尤為重要。
　　酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）作為

2、小分子化合物檢測分析中的一種新興技術(shù)，在中藥有效成分的檢測分析中備受關(guān)注。與傳統(tǒng)的檢測方法相對比，ELISA方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作便捷，樣品前處理工藝簡單，無需使用精密儀器，對操作人員技能要求不高等特點，所以，非常適用于基層快速檢測。
　　具體研究結(jié)果如下：
　　（1）利用琥珀酸酐法對龍膽苦苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，其目的是為了引入能與載體蛋白直接進(jìn)行偶聯(lián)的活性基團(tuán)——羧基。薄層色譜法（TLC）鑒定結(jié)果表明修飾后確有一種新物

3、質(zhì)生成，且純度較高；質(zhì)譜技術(shù)（MS）鑒定結(jié)果顯示修飾后產(chǎn)物的分子量與理論值相符，這表明已成功獲得了羧基化的龍膽苦苷。
　　（2）利用混合酸酐法將羧基化的龍膽苦苷與牛血清白蛋白（BSA）和雞卵清蛋白（OVA）成功偶聯(lián)，獲得了龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA。組合利用TLC法、紅外光譜法（IR）、紫外-可見分光光度計法（UV）、聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）和三硝基苯磺酸法（TNBS）進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果均表明已

4、成功獲得了龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA，并且以TNBS法測得龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA的結(jié)合比分別是9:1和6:1。
　　（3）以人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA為免疫原進(jìn)行免疫實驗，并以新西蘭大白兔為免疫對象，分別以基礎(chǔ)飼料和谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料進(jìn)行喂飼，結(jié)果顯示谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料組的大白兔在體重、精神狀態(tài)、活動狀態(tài)、皮毛色澤和食欲狀況等指標(biāo)均優(yōu)于基礎(chǔ)飼料組，表明谷胱甘肽可有效緩解免疫動

5、物在免疫過程中所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，為動物免疫提供了新思路。
　?。?）建立并優(yōu)化了間接GTP-ELISA法，結(jié)果顯示：最適包被液是碳酸鹽緩沖液，最適封閉液是山羊血清，最適抗體稀釋液是PBS+0.5％BSA，包被抗原的最適工作濃度是1:2000，酶標(biāo)二抗的最適工作濃度是1:3000。
　　利用間接GTP-ELISA測得各實驗組的免疫血清效價均達(dá)到了1:12800以上，且以GTP-BSA為免疫抗原所產(chǎn)生的免疫血清效價明顯高于以GT

6、P-OVA為免疫抗原所產(chǎn)生的免疫血清效價。
　　（5）建立并優(yōu)化了間接競爭GTP-ELISA法，結(jié)果顯示：最適競爭反應(yīng)時間是40min，最適有機(jī)溶劑是10%的甲醇溶液，洗滌液的最適pH值是7.5。
　　利用間接競爭GTP-ELISA法對其靈敏度(IC50)和特異性進(jìn)行檢測,并計算出與5種龍膽苦苷結(jié)構(gòu)相似物的交叉反應(yīng)率。結(jié)果顯示:IC50分別是95.2ng/mL、38.9ng/mL、41.5ng/mL和10.9ng/mL;競爭

7、抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程分別為y=18.666x-22.452(R~2=0.9722),y=19.07x-18.3315(R~2=0.9658),y=16.872x-12.188(R~2=0.9714)和y=15.523x-1.4934(R~2=0.9688)。
　　4個實驗組與龍膽苦苷的交叉反應(yīng)率均為100%，對獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的交叉反應(yīng)率均＜0.5%，對梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷的交叉反應(yīng)率均＜0.1%，這表明4個實驗組的