人胱抑素C抗體制備和檢測方法建立及其方法學評價.pdf

1、胱抑素 C (cystatin C，Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，其血清濃度測定是優(yōu)于傳統(tǒng)的血尿素、尿酸、肌酐和內(nèi)生肌酐清除率測定的新的腎功能評價指標。2002年FDA網(wǎng)上公布了26個在檢驗醫(yī)學有重大突破的全新檢測項目，血清 (漿)Cys C測定便是其中之一。但目前臨床試驗室測定Cys C均為需要昂貴特殊儀器和試劑盒的方法，制約了其推廣應用。 目的： 構建人Cys C的原核表達載體，將純化的Cys C重組蛋白免疫

2、大白兔，制備Cys C抗血清，為建立Cys C的檢測方法奠定基礎；用自制的Cys C抗血清，建立可在自動生化分析儀上定量測定血清Cys C的顆粒增強透射免疫分析法(particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)，并進行方法學評價，為該法的臨床應用奠定基礎；用純化的重組Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，制備Cys C單克隆抗體，為進一步建立Cys C其他免疫學測定方法，以及研究Cys

3、 C的其他生物學作用和機制提供基礎。 方法： 1．采用RT-PCR技術，從細胞中擴增Cys C目的基因，并將其克隆到 pET32a(+)原核表達載體，構建重組 Cys C 原核表達質(zhì)粒pET32a(+)/Cys C。 2．將構建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，誘導重組蛋白表達，表達蛋白經(jīng)鎳離子親和層析系統(tǒng)純化，并進行鑒定。 3．用純化重組蛋白免疫大白兔，制備Cys C抗血清。 4．采用自

4、制提純的Cys C抗血清包被乳膠顆粒，建立可在自動生化分析儀上定量測定Cys C的PETIA，并將此法與進口商品化試劑盒進行比對實驗，以及進行準確度、精密度、線性范圍、檢測限、干擾試驗等方法學評價試驗。 5．用純化重組的Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，經(jīng)過克隆化和篩選，建立穩(wěn)定分泌抗Cys C的雜交瘤細胞株，并通過動物體內(nèi)誘生腹水大量制備單克隆抗體。 結果：

5、 1．經(jīng)基因克隆及重組技術，獲得了35 kD的Cys C融合蛋白，其表達形式為不溶性包涵體，此包涵體蛋白經(jīng)Ni<'2+>親和層析能有效純化；以該蛋白免疫大白兔制備了Cys C抗血清。 2．采用自制提純的Cys C抗血清包被乳膠顆粒，建立了可在自動生化分析儀上定量測定Cys C的PETIA，方法學評價實驗顯示該法具有較好的檢測性能指標，并與進口的商品試劑盒有很好的可比性，符合臨床應用要求。 3．采用雜交瘤技術，建立了穩(wěn)定

6、分泌抗Cys C單克隆抗體的 2 株雜交瘤細胞株，將其中 1 株細胞注射于小鼠腹腔，得到了富含Cys C單克隆抗體的小鼠腹水。 結論： 1．經(jīng)基因重組技術獲得了35 kD的Cys C融合蛋白，利用此蛋白抗原制備得到兔抗人Cys C抗血清(多克隆抗體)，并成功制備了鼠抗人Cys C單克隆抗體。 2．采用自制的Cys C抗血清，建立了在自動生化分析儀上定量測定Cys C的PETIA，該法具有較好的性能指標，與商品化進