膠孢炭疽菌ES026石杉?jí)A甲合成途徑關(guān)鍵酶基因CgCAO、CgLDC的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、石杉?jí)A甲(Huperzine A)作為新一代治療阿爾茨海默病的藥物具有較好的前景，最先是從石松科植物中發(fā)現(xiàn)并提取，但由于人工合成石杉?jí)A甲技術(shù)不成熟，植物資源匱乏，所以其產(chǎn)量受到了極大的限制。近些年來(lái)，很多學(xué)者分離報(bào)道很多產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌，由于這一報(bào)道結(jié)果，因此分離產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生菌已成為新的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)材料是根據(jù)在前期研究試驗(yàn)中從蛇足石杉植物中分離得到了一株產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌膠孢炭疽菌ES026，并已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利。在本研究中，根據(jù)前

2、期對(duì)膠孢炭疽菌ES026的基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析及基因功能注釋結(jié)果，得出賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶被注釋到石杉?jí)A甲生物合成路徑中，為了驗(yàn)證賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶的功能，本研究主要做了一下幾個(gè)方面的內(nèi)容:
　　1.成功在膠孢炭疽菌ES026中克隆了賴氨酸脫羧酶基因（CgLDC）和銅胺氧化酶基因(CgCAO)，CgLDC序列全長(zhǎng)769 bp，CgCAO序列全長(zhǎng)2072 bp。
　　2.CgLDC和CgCAO的體外異源表達(dá)

3、與蛋白純化構(gòu)建異源表達(dá)載體:pET28a-CgLDC和pET28a-CgCAO，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中。優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件，并利用優(yōu)化后的蛋白純化方法得到純化后的CgLDC蛋白和CgCAO蛋白進(jìn)行體外酶促活性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)CgLDC具有催化L-Lysine生成尸胺的能力，CgCAO具有催化尸胺生成△1-Piperideine的能力。
　　3.膠孢炭疽菌ES026中CgLDC基因和CgCA