膠胞炭疽菌ES026 T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建.pdf

1、我國傳統(tǒng)藥用植物蛇足石杉的次級代謝產(chǎn)物石杉堿甲是一種高效的乙酰膽堿酯酶抑制劑，是治療老年癡呆癥的一個前景藥物。人工合成石杉堿甲工藝復(fù)雜、成本昂貴、且得率較低，目前市場上石杉堿甲主要來源于野生蛇足石杉等石杉科植物。但石杉科植物生長周期長、生態(tài)環(huán)境復(fù)雜、資源開采過度、因含內(nèi)生菌人工組培快繁又難以獲得無菌苗，使得天然石杉堿甲的產(chǎn)量受到極大限制。基于內(nèi)生真菌與其共生植物可以交換遺傳物質(zhì)這一理論，從蛇足石杉中分離產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌已成為新的研究

2、熱點。本實驗室在前期研究工作中已從蛇足石杉中分離出一株產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌Colletotrichum gloeosporioidesES026，并已經(jīng)申請專利。目前為止所獲得的產(chǎn)石杉堿甲的菌株所產(chǎn)的石杉堿甲量還很低，整個石杉堿甲生物合成途徑仍不完全，相關(guān)基因的研究鮮見報道，因此利用內(nèi)生菌大量生產(chǎn)石杉堿甲還未應(yīng)用到實踐當(dāng)中。本研究以分離得到的內(nèi)生真菌ES026為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建T-DNA插入突變體庫，并利用TAIL-PCR

3、與Inverse-PCR等技術(shù)手段對石杉堿甲合成途徑中的相關(guān)基因進行克隆。旨在為培育石杉堿甲高產(chǎn)菌株、探究石杉堿甲合成途徑，從而為利用微生物生產(chǎn)石杉堿甲奠定基礎(chǔ)，同時為相關(guān)研究提供參考。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的C.gloeosporioidesES026的高效轉(zhuǎn)化體系。在共培溫度為25℃，共培時間為48h，400μM的乙酰丁香酮(AS)，農(nóng)桿菌濃度OD600=0.3-0.5，孢子濃度為1×106個/mL時，轉(zhuǎn)

4、化效率最高，達95個轉(zhuǎn)化子/皿。目前利用此優(yōu)化條件已建立了約含4000個轉(zhuǎn)化子的膠孢炭疽菌ES026T-DNA插入突變體庫。
　　2.對農(nóng)桿菌介導(dǎo)C.gloeosporioidesES026的突變體庫的遺傳穩(wěn)定性進行了評估。從突變體庫內(nèi)隨機選取13個轉(zhuǎn)化子，在不含潮霉素和頭孢霉素的PDA上連續(xù)培養(yǎng)5代，然后轉(zhuǎn)到含200μg/mL潮霉素和150μg/mL頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有測試的轉(zhuǎn)化子各子代均能在選擇培養(yǎng)基上生長，而

5、野生型菌株C.gloeosporioidesES026不能生長。而且通過潮霉素特異性引物擴增，所有測試的轉(zhuǎn)化子各子代和農(nóng)桿菌載體均在1101bp處有擴增條帶，而野生型菌株C.gloeosporioidesES026未擴增出條帶，這說明T-DNA標(biāo)記轉(zhuǎn)化子在遺傳上是穩(wěn)定的。
　　3.從突變體庫中任選100個突變菌株對其發(fā)酵產(chǎn)物進行了表型的篩選，得到EST010005、EST010010、EST010021、EST010043、EST

6、010044等5株表型較野生型菌株ES026有變化的菌株。對這5株突變菌株的石杉堿甲含量進行了液相分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變菌株EST010044的石杉堿甲含量（7.73μg.g-1CDW）顯著高于野生型菌株ES026的石杉堿甲含量（4.23μg.g-1CDW），約為1.83倍。而突變菌株EST010005(2.75μg.g-1CDW)、EST010043（2.78μg.g-1CDW）的石杉堿甲含量顯著低于野生型菌株ES026，分別為其含量的

7、0.65、0.66倍。
　　4.為了評價表型突變菌株的T-DNA插入拷貝數(shù)，我們采取了基因組southern雜交分析的技術(shù)手段。經(jīng)過southem雜交分析結(jié)果表明，有四個突變菌株(EST010005、EST010021、EST010010和EST010044)是單拷貝，單拷貝率達到了80％,而僅有一株(EST010043)是雙拷貝，說明該插入體庫具有較高的單拷貝比例。
　　5.通過TAIL-PCR和Inverse-PCR技術(shù)