子宮內(nèi)膜相關(guān)芯片的通路富集分析及其在豬繁殖機(jī)理研究中的應(yīng)用.pdf

1、繁殖性能對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)而言,直接關(guān)乎生產(chǎn)成本,進(jìn)而影響經(jīng)濟(jì)效益,意義重大。很多因素都會(huì)影響到豬繁殖性能。其中子宮內(nèi)膜作為雌性生殖器官的一部分,是維持生理特征和生育功能的重要器官。子宮內(nèi)膜具有高度增殖活性,然而它又極易受流產(chǎn)、感染、內(nèi)分泌等多種因素的影響,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的再生能力下降,容受性降低,嚴(yán)重影響繁殖力?；蛐酒呛蠡蚪M學(xué)時(shí)代基因功能分析的重要技術(shù)之,已廣泛地應(yīng)用于人類疾病和模式生物復(fù)雜性狀遺傳機(jī)制的研究。南于基因芯片的成本高,微陣列

2、的制備、樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記比較繁瑣,分析系統(tǒng)價(jià)格昂貴,信號(hào)的假陽(yáng)性率高等,使得該技術(shù)的普及與推廣存在一定的難度。而且基因芯片的分析及注釋需要較完備的基因組序列信息,使之在豬等家畜中的應(yīng)用受到極大的限制,許多研究者只能應(yīng)用低密度微陣列或跨物種基因芯片進(jìn)行相關(guān)研究。在豬等農(nóng)業(yè)動(dòng)物的研究方面,雖然應(yīng)用基因芯片已檢測(cè)出許多與重要經(jīng)濟(jì)性狀、疾病等相關(guān)的基因,但就這些基因在豬的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和疾病發(fā)生發(fā)展中所擔(dān)任的角色、相互作用機(jī)制仍未完全明確。因此對(duì)

3、豬的遺傳育種,可以從比較基因組學(xué)的角度出發(fā),利用人及小鼠等模式生物的全基因組信息,對(duì)其進(jìn)行服務(wù)。
　　 對(duì)子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病和異常的全基因組研究,在人及牛等其它物種上,積累了不少數(shù)據(jù),而且注釋信息完整。因此,我們可以通過(guò)對(duì)已有的人、牛相關(guān)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整合,再通過(guò)比較基因組學(xué)的辦法進(jìn)行同源基因比對(duì),以期得到影響豬子宮內(nèi)膜的關(guān)鍵通路和候選基因。為進(jìn)一步研究影響豬繁殖性能的分子遺傳機(jī)制和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。
　　

4、本論文的研究工作主要包括以下內(nèi)容:
　　 1.子宮內(nèi)膜異位癥芯片數(shù)據(jù)的通路富集分析及整合
　　 首先將從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到的相關(guān)數(shù)據(jù),采用統(tǒng)一的預(yù)處理方法進(jìn)行處理,然后應(yīng)用基因集富集分析方法對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,最后對(duì)每套的結(jié)果進(jìn)行整合分析。結(jié)果表明,在卵巢型的3套數(shù)據(jù)集中,發(fā)現(xiàn)17個(gè)共同上調(diào)的通路和23個(gè)共同下調(diào)的通路。在腹膜型的2套數(shù)據(jù)中,有26個(gè)上調(diào)通路是一致的,有1個(gè)下調(diào)通路是一致的。比較這兩

5、種類型的分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)有13個(gè)相同的上調(diào)通路和1個(gè)相同的下調(diào)通路。這些通路主要與免疫疾病和免疫系統(tǒng)相關(guān)。對(duì)子宮周期的數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,分泌早期有12個(gè)顯著上調(diào)通路和18個(gè)顯著下調(diào)通路,分泌中期沒(méi)有顯著上調(diào)通路,只有29個(gè)顯著下調(diào)通路。對(duì)3個(gè)時(shí)期得到的通路進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)彼此之間交集很少。對(duì)以子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞為樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析,得到46個(gè)顯著上調(diào)通路和1個(gè)顯著下調(diào)通路。將其與以上結(jié)果比較,得到2個(gè)共同通路。通過(guò)GSEA方法得到的

6、上述結(jié)果更容易解釋也更可靠,提高了微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證指出了方向,并為在分子水平上研究豬繁殖機(jī)理提供了參考通路和基因。
　　 2.能量負(fù)平衡對(duì)子宮內(nèi)膜相關(guān)通路及基因的影響
　　 研究日糧能量水平對(duì)母豬子宮內(nèi)膜的影響,對(duì)于合理飼養(yǎng)育成期母豬以及提高繁殖率和經(jīng)濟(jì)效益,都具有重要的意義。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中奶牛能量負(fù)平衡的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù),采用基因集富集分析的方法,篩選能量負(fù)平衡時(shí),子宮內(nèi)膜顯著差異表達(dá)的

7、相關(guān)通路和基因,。分析得到23個(gè)顯著上調(diào)通路和26個(gè)顯著下調(diào)通路。上調(diào)通路中,大部分是免疫系統(tǒng)和免疫性疾病相關(guān)通路。其中,Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等7個(gè)通路是免疫系統(tǒng)相關(guān)通路,而原發(fā)性免疫缺陷、自身免疫性甲狀腺疾病等5個(gè)通路與免疫性疾病相關(guān)。顯著下調(diào)的通路中,主要是代謝相關(guān)通路、氧化磷酸化通路和細(xì)胞周期通路等。
　　 免疫性疾病相關(guān)通路,神經(jīng)退行性疾病相關(guān)通路和生物合成相關(guān)通路最多。分別將這三類通路包括的基因進(jìn)

8、行比較,得到了相關(guān)的三個(gè)核心基因列表。與免疫性疾病相關(guān)的核心基因是BOLA,BOLA-DMA,BOLA-DMB,BOLA-DQA1,BOLA-DQA2,BOLA-DQA5,BOLA-DQB,BOLA-DRA,BOLA-DRB3,CD80,CD86,FAS,GZMB,LOC12672,LOC525727和PRF1;與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因列表為ATP5F1,ATP5G1,ATP5G3,COX7A2,CYC1,NDUFA5。NDUFB2,

9、NDUFB5,NDUFB7,NDUFC1,NDUFS6,NDUFS8,NDUFV1和UOCRB；與生物合成相關(guān)通路相關(guān)的核心基因列表為ALDOC,CS,DLD,IDH1,MDH2,PDHA1,PFKM,和PKM2。
　　 3.影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路及基因篩選
　　 通過(guò)分析疾病和能量對(duì)子宮內(nèi)膜的影響,我們發(fā)現(xiàn)了很多共同的通路和基因。這些共同的通路可以作為研究豬子宮內(nèi)膜的候選通路,而共同的基因,可以映射到豬的染色體上,作

10、為影響豬子宮內(nèi)膜的重要基因。我們將人卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥芯片數(shù)據(jù)和能量負(fù)平衡數(shù)據(jù)的分析結(jié)果相比,發(fā)現(xiàn)相同的上調(diào)通路有12個(gè)和下調(diào)通路有10個(gè)。這22個(gè)通路可作為影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路,其中包含的同源基因是我們重點(diǎn)關(guān)注的基因。此外,PPAR信號(hào)通路僅在一套數(shù)據(jù)中小顯著,也作為候選通路納入結(jié)果中,共得到23個(gè)候選通路。對(duì)每個(gè)通路包括的基因進(jìn)行提取,合并,去重復(fù),共得到212個(gè)人Entrez基因。將這212個(gè)人的Entrez基因通過(guò)BioM

11、art數(shù)據(jù)庫(kù),在豬染色體上尋找對(duì)應(yīng)的同源基因,并對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的染色體位置上。有比對(duì)結(jié)果的Entrez基因有168個(gè),其中122個(gè)人Entrez基因?qū)?yīng)140個(gè)豬Unigene同源基因,其它Entrez基因沒(méi)有找到對(duì)應(yīng)的豬unigene同源基因,但得到了相應(yīng)同源基因在豬染色體上對(duì)應(yīng)的起始位置。
　　 4.豬胚胎和子宮內(nèi)膜發(fā)育相關(guān)內(nèi)參基因的篩選
　　 胚胎發(fā)育到胎膜與子宮內(nèi)膜附著是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程。人們對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行了很多研究,

12、實(shí)時(shí)定量PCR因其快速可靠的特點(diǎn)已經(jīng)成為分析基因轉(zhuǎn)錄水平的常用手段,通常使用看家基因進(jìn)行相對(duì)定量。然而很多看家基因隨著環(huán)境的改變其表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。而微陣列芯片數(shù)據(jù)包含了整個(gè)基因組的信息,可以供我們篩選在特定組織中穩(wěn)定表達(dá)的基因,將其作為內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量。我們應(yīng)用元分析辦法整合多套關(guān)于豬胚胎和子宮內(nèi)膜發(fā)育的芯片數(shù)據(jù),初步篩選出表達(dá)穩(wěn)定的前100個(gè)候選內(nèi)參皋因,大部分為編碼核糖體蛋白的基因。
　　 綜上所述,本文通過(guò)對(duì)人和牛相

13、關(guān)芯片數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)在疾病和能量差異情況下,在子宮內(nèi)膜顯著差異表達(dá)的相關(guān)通路和基因,并采用比較基因組學(xué)的方法,將所發(fā)現(xiàn)的相同通路和基因,映射到豬染色體上,并對(duì)應(yīng)得到豬的同源皋因。這些通路和基因可作為影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路和基因,不僅可以對(duì)現(xiàn)有繁殖相關(guān)基因有更深入的了解,還有助于發(fā)現(xiàn)新的與繁殖性狀相關(guān)的重要候選基因,為母豬繁殖性狀標(biāo)記輔助選擇(MAS)和標(biāo)記輔助導(dǎo)入(MAI)提供新的依據(jù)。最后,利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中與豬胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜