水通道蛋白在人子宮內(nèi)膜中的表達及其調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、自1992年AgrePeter教授首次由人紅細胞膜中分離和鑒定出水通道蛋白1(aquaporin1，AQP1)以來，針對水通道蛋白的研究不斷深入，現(xiàn)已證明水通道蛋白為一大家族，其成員廣泛分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，介導(dǎo)水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞容積和細胞內(nèi)滲透壓以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生理作用，該發(fā)現(xiàn)被譽為生命科學研究的又一個里程碑，AgrePeter教授因此榮獲2003年諾貝爾化學獎；生殖生理和生殖病理的研究一直是熱點問題，生殖

2、過程的許多方面涉及到液體的改變，如卵泡的生長發(fā)育、胚泡的發(fā)育、精子的發(fā)生成熟、精液的形成以及子宮內(nèi)膜和子宮腔液的周期性變化等等；研究證實有多種水通道蛋白豐富地表達于睪丸、精子、卵泡、子宮、胎盤、胎膜等組織，因此，研究水通道蛋白在生殖系統(tǒng)的表達、作用及其調(diào)節(jié)機制具有重要的生理學意義；然而，該家族成員是否存在于人子宮內(nèi)膜中?若存在，其表達特性如何?是否與月經(jīng)周期存在一定的關(guān)系?是否受到卵巢甾體激素調(diào)節(jié)?這一系列問題至今尚未見報道。本研究針對

3、上述問題進行了系列研究和探索。 第一部分水通道蛋白在人子宮內(nèi)膜中的表達目的：檢測水通道蛋白家族成員aquaporin1～9(AQP1～AQP9)在人子宮內(nèi)膜中的表達情況。 方法：逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)篩查AQP1～AQP9在人子宮內(nèi)膜(增生期和分泌期各10例)是否表達；免疫組織化學法檢測AQP1，AQP2，AQP8在人子宮內(nèi)膜中的定位與分布。 結(jié)果：人子宮內(nèi)膜中可檢測到AQP1，AQP2，AQP8m

4、RNA的表達，未發(fā)現(xiàn)AQP3，AQP4，AQP5，AQP6，AQP7，AQP9mRNA的表達；AQP1僅表達于子宮內(nèi)膜的毛細血管及小血管內(nèi)皮，內(nèi)膜腺上皮和腔上皮陰性表達；AQP2主要表達于內(nèi)膜腔上皮和腺上皮，間質(zhì)弱陽性表達；AQP8主要表達于內(nèi)膜的腺上皮，間質(zhì)和腔上皮微弱陽性表達。 結(jié)論：在被檢測的9種水通道家族成員中，僅有三種(AQP1，AQP2，AQP8)表達于人子宮內(nèi)膜，且呈特定的組織學分布。 第二部分水通道蛋白2

5、在人子宮內(nèi)膜中的周期性表達及其與性激素的相關(guān)性 目的：探討水通道蛋白2(aquaporin2，AQP2)在人不同時期子宮內(nèi)膜表達的變化及其與血清雌孕激素水平的相關(guān)性。 方法：對113例正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜(其中增生早中期23例，增生晚期15例，分泌早期31例，分泌中期34例，分泌晚期10例)采用免疫組織化學法和半定量蛋白免疫印跡技術(shù)檢測AQP2的定位和表達，實時RT-PCR方法檢測其mRNA水平的表達。同時應(yīng)用電化學發(fā)

6、光法測定血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，分析AQP2表達量與E2、P的相關(guān)性。 結(jié)果：1.AQP2主要表達于人子宮內(nèi)膜的腔上皮和腺上皮，內(nèi)膜間質(zhì)弱陽性表達。2.AQP2的相對表達量呈月經(jīng)周期依賴性變化：增生早中期為(1.08±0.09)，顯著低于增生晚期的(1.95±0.13)、分泌早期的(1.325±0.139)和分泌中期的(1.634±0.153)(P均＜0.01)；但與分泌晚期(1.09±0.06)相比差異無顯著性(P

7、＞0.05)；AQP2在增生晚期的相對表達量明顯高于其他各期(P均＜0.01)，分泌中期高于分泌早期(P＜0.05)。3.AQP2mRNA在不同時期子宮內(nèi)膜的△Ct之間的差異均無顯著性(分別是0.5775±0.3527，0.6108±0.4202，0.5783±0.3655，0.6002±0.3802，0.5609±0.3487；P＞0.05)。4.AQP2蛋白相對表達量與血清E2呈正相關(guān)(r2=0.6183，P＜0.01)；與血清P以

8、及E2/P無相關(guān)性(分別是r2=0.031，r2=0.058；P＞0.05)。 結(jié)論：1.AQP2主要表達于人子宮內(nèi)膜的腔上皮和腺上皮，且表達量隨月經(jīng)周期而變化：增生期晚期最高；其次是分泌中期；2.AQP2在增生晚期的高表達，可能與該時期的宮腔液黏滯度降低有關(guān)；而在分泌中期的高表達，可能與子宮內(nèi)膜容受性的建立有關(guān)。 第三部分人子宮內(nèi)膜水通道蛋白2表達的調(diào)節(jié)機制研究 目的：探討雌、孕激素對體外培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜上皮細

9、胞水通道蛋白2(aquaporin2，AQP2)表達的影響及其機制。 方法：1.人子宮內(nèi)膜上皮細胞原代培養(yǎng)，平行設(shè)立對照組和處理組，處理組分別給予雌二醇E2(10-8mol/L)、孕酮P4(10-6mol/L)、E2(10-8mol/L)+P4(10-6mol/L)、E2(10-8mol/L)+ICI182780(10-7mol/L)(一種“純，，的雌激素受體的拮抗劑)刺激，實時RT-PCR、半定量蛋白免疫印跡技術(shù)分別檢測AQP

10、2mRNA和蛋白表達量的變化；2.細胞膨脹和抑制實驗，首先行人子宮內(nèi)膜上皮細胞原代培養(yǎng)，平行設(shè)立對照組和處理組，處理組先以E2(10-8mol/L)培養(yǎng)24小時后加入水通道抑制劑氯化汞(HgCl2，50μmol/L)，共同培養(yǎng)48小時，流式細胞儀檢測低滲(210mOsM)前后(0min和2min)不同處理細胞平均大小的改變。 結(jié)果：1.E2組AQP2蛋白表達水平明顯高于P4組、E2+ICI182780組、E2+P4組和對照組(分

11、別為0.5001±0.0256，0.2536±0.044，0.2776±0.0235，0.2611±0.0219和0.2653±0.019；P＜0.01)。2.E2組AQP2mRNA表達水平明顯高于P4組、E2+ICI182780組、E2+P4組和對照組(分別為0.286±0.072，0.153±0.015，0.150±0.014，0.151±0.009，0.161±0.010；P＜0.01)。3.E2組內(nèi)膜上皮細胞低滲后細胞平均體積(

12、μm)明顯大于處理前(分別為200.10±10.02，240.89±30.76；P＜0.01)，E2+HgCl2處理組在低滲前后無差異(分別為220.96±15.79；227.74±19.35：P＞0.05)。 結(jié)論：1.雌激素能夠上調(diào)人子宮內(nèi)膜上皮細胞AQP2mRNA和蛋白的表達；而孕激素削弱雌激素對AQP2表達的上調(diào)作用；2.雌激素通過其受體發(fā)揮對子宮內(nèi)膜上皮細胞AQP2的調(diào)節(jié)作用；3.雌激素可能通過AQP2途徑增加人子宮內(nèi)