g10-L翻譯增強序列提高外源蛋白表達的初步研究.pdf

1、葉綠體基因工程是高效表達外源蛋白的有效途徑之一。與核轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，具有許多優(yōu)點:如基因拷貝數(shù)多，表達率高，遺傳性狀穩(wěn)定，生物安全性高，能夠避免基因沉默和位置效應(yīng)等。翻譯效率是決定表達能力的關(guān)鍵因素，一些翻譯增強子能明顯提高重組蛋白的表達。來源于T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列(g10-L)的一段九個堿基的翻譯增強子序列(UUAACUUUA)已被證實在大腸桿菌中能明顯提高多種外源基因表達產(chǎn)量達40～340倍，其原理可能是增強mRNA與16S核糖

2、體的識別結(jié)合能力進而促進翻譯。
　　 實現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化需要一個有效的轉(zhuǎn)化載體，這種轉(zhuǎn)化載體中必須具備幾個基本元件:同源重組的同源臂、完整的外源基因表達盒（包括啟動子、目的基因和調(diào)控序列）、篩選標記基因。Lux Ct是以熒光素酶基因Lux AB為基礎(chǔ)進行適當(dāng)改造而成，含有高效的內(nèi)源性atpA基因啟動子及5'UTR和3'UTR，表達盒為atpA5'UTR-gfp基因-rbcL3'UTR。Lux Ct為一種穿梭載體，既可以在原核生物中表

3、達，也可以在真核生物中表達，但是不能進行誘導(dǎo)表達。
　　 腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性過程。Canstatin是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，為Ⅳ型膠原α2鏈的非膠原區(qū)。在體外，它能抑制血管內(nèi)皮細胞的增生、遷移，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡;在體內(nèi)，能有效抑制腫瘤的生長。目前，通過抑制血管生成的這種“休眠療法”在臨床應(yīng)用上具有更廣闊的應(yīng)用前景。我們在本研究中構(gòu)建含有人Canstatin的重組表達載體，通過檢測Cansta

4、tin蛋白表達量的變化來驗證g10-L翻譯增強序列提高外源蛋白表達的功能。
　　 方法:
　　 我們首先根據(jù)Genbank上登錄的人Canstatin cDNA序列設(shè)計引物，以提取的人非小細胞肺癌A549細胞總RNA為模板，利用RT-PCR的方法克隆出人Canstatin基因全長，以及分別在5'UTR下游和3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強序列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段，并將其分別克隆在pM

5、D18-T載體上并用PaeR7 I、SphI進行酶切鑒定。然后利用酶切、連接等方法將表達盒為atpA5，UTR-gfp基因-rbcL3'UTR的Lux Ct構(gòu)建成表達盒為atpA5，UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的人Canstatin葉綠體表達載體，同時分別構(gòu)建在5，UTR下游和3，UTR上游添加了g10-L翻譯增強序列的葉綠體表達載體，并用PaeR7 I、Sph I進行酶切鑒定。之后為了能夠分別在5'UTR上游和3

6、'UTR下游添加g10-L翻譯增強序列，對第一部分的實驗進行補充，我們又采用一種新的方法。以構(gòu)建好的不添加g10-L翻譯增強序列的表達盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的重組載體為模板，設(shè)計兩對引物進行PCR，分別擴增得到在5，UTR上游、3，UTR下游添加g10-L翻譯增強序列的atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3'UTR片段。之后分別連接在pMD18-T載體上并用Ava I、SphI

7、進行酶切鑒定，則分別在5，UTR上游、3'UTR下游添加g10-L翻譯增強序列的原核表達載體構(gòu)建完成。最后，將構(gòu)建好的重組表達載體分別在大腸桿菌DH5α中進行原核表達，提取蛋白，并用western blotting的方法進行檢測，初步驗證g10-L翻譯增強序列（UUAACUUUA）提高外源蛋白表達的功能。
　　 結(jié)果:
　　 1.人Canstatin基因片段以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g10-L翻譯增強序

8、列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段的擴增
　　 用TRIzol試劑提取A549細胞總RNA，28S和18S條帶清楚，說明純度較高。利用RT-PCR方法得到700 bp左右的人Canstatin基因全長以及添加了g10-L翻譯增強序列的人Canstatin基因片段，并且克隆在pMD18-T載體上，酶切鑒定正確。
　　 2.人Canstatin葉綠體表達載體以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g1

9、0-L翻譯增強序列(UUAACUUUA)的人Canstatin葉綠體表達載體的構(gòu)建
　　 利用酶切、連接的方法構(gòu)建了表達盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的人Canstatin葉綠體表達載體，同時分別構(gòu)建在5'UTR下游和3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強序列的人Canstatin葉綠體表達載體，并經(jīng)酶切鑒定說明構(gòu)建成功。
　　 3.補充構(gòu)建分別在5'UTR上游、3'UTR下游添加g1

10、0-L翻譯增強序列(UUAACUUUA)的人Canstatin原核表達載體
　　 按照上述方法進行構(gòu)建，經(jīng)酶切鑒定結(jié)果表明分明在5'UTR上游、3'UTR下游添加g10-L翻譯增強序列的表達盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3'UTR的原核表達載體構(gòu)建成功，對第一部分載體的構(gòu)建進行了補充。同時也構(gòu)建了不添加翻譯增強序列以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g10-L翻譯增強序列的人Canstatin原

11、核表達載體。
　　 4.人Canstatin蛋白的原核表達以及western blotting檢測
　　 將兩組構(gòu)建好的重組表達載體分別在大腸桿菌DH5α中進行原核表達，提取蛋白，之后進行western blotting檢測。結(jié)果顯示在24 KDa處出現(xiàn)特異性條帶，并且添加了g10-L翻譯增強序列的表達載體的條帶要強于沒有添加翻譯增強序列的表達載體的條帶，說明蛋白表達量有所提高?？梢猿醪秸f明g10-L增強序列(UUAAC

12、UUUA)對外源蛋白的表達有增強作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功構(gòu)建了人Canstatin葉綠體表達載體以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強序列的人Canstatin葉綠體表達載體。
　　 2.本研究成功構(gòu)建了人Canstatin原核表達載體以及分別在5'UTR上游下游、3'UTR上游下游添加了g10-L翻譯增強序列的人Canstatin原核表達載體。
　　 3.We