噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37和gp38在宿主識(shí)別過(guò)程中的作用及其受體鑒定.pdf

1、有尾噬菌體侵染細(xì)菌首先利用尾絲蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)侵染過(guò)程。本研究以肌尾噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37和gp38為研究對(duì)象，探索其尾絲蛋白gp37和gp38在宿主識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮的作用。具體內(nèi)容包括以下三個(gè)方面：
　?。?）尾絲蛋白gp37和gp38的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)。利用分子生物學(xué)軟件對(duì)尾絲蛋白 gp37和gp38進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尾絲蛋白gp37和gp38都與T2噬菌體親緣關(guān)系較近，與T4噬

2、菌體親緣關(guān)系很遠(yuǎn)。對(duì)尾絲蛋白gp37和gp38之間的連接序列分析發(fā)現(xiàn)二者之間存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，暗示gp38可能與gp37在尾絲上相鄰排列，是噬菌體Bp7的結(jié)構(gòu)蛋白。以噬菌體Bp7基因組為模板，PCR擴(kuò)增噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37和gp38基因序列，以pcoldTF為載體，構(gòu)建pcoldTF-gp37和pcoldTF-gp38重組表達(dá)質(zhì)粒，在E.coli BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE及West

3、ern-blot鑒定。pcoldTF為載體的兩個(gè)尾絲蛋白實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，親和層析純化蛋白，免疫家兔，分別制備尾絲蛋白gp37和gp38的多克隆抗體，用于后期試驗(yàn)。
　　（2）尾絲蛋白gp37和gp38在宿主識(shí)別過(guò)程中的作用。通過(guò)免疫電鏡試驗(yàn)，證實(shí)尾絲蛋白gp38作為結(jié)構(gòu)蛋白位于噬菌體的長(zhǎng)尾絲上。通過(guò)尾絲蛋白競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)和抗體阻斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尾絲蛋白gp38及其抗血清能夠完全抑制噬菌體對(duì)宿主菌的吸附作用，而gp37的抗血清不能抑制噬菌

4、體吸附宿主菌，表明尾絲蛋白gp38位于噬菌體Bp7的長(zhǎng)尾絲末端，在宿主識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　?。?）噬菌體Bp7識(shí)別受體的篩選與鑒定。利用醋酸鈉和蛋白酶K分別處理宿主菌E.coli K12，與未處理的對(duì)照組比較，噬菌體Bp7的吸附率分別下降25％和10%，表明噬菌體Bp7識(shí)別的受體種類(lèi)包括脂多糖和蛋白類(lèi)，脂多糖為其主要的識(shí)別受體，膜蛋白為其次要受體。熱-酚水法提取 E.coli K12脂多糖，進(jìn)行阻斷試驗(yàn)，結(jié)果表明噬菌體 B