人天然Fab段噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗gp96抗體的初步篩選.pdf

1、背景和目的：熱休克蛋白gp96作為分子伴侶參與了腫瘤抗原向MHC-I類(lèi)分子途徑的遞呈過(guò)程，并與抗原肽形成gp96-肽復(fù)合物激活CD8+T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。因此，gp96-肽復(fù)合物疫苗為腫瘤的免疫治療提供了新的思路。但是，如此充滿(mǎn)前景的療法需要從有限的腫瘤組織中快速提取高純度的gp96，傳統(tǒng)的方法因?yàn)樾枰褂肅onA-Sepharose柱，很容易造成ConA的污染，而ConA本身是一種T細(xì)胞絲裂原，可對(duì)疫苗接種者的免疫

2、系統(tǒng)產(chǎn)生有害作用。所以，尋找一種快速有效而又高度特異性的方法分離純化gp96，就成為該疫苗大規(guī)模臨床應(yīng)用所要解決的首要問(wèn)題。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可有效地解決以上問(wèn)題。我們利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建人天然Fab段噬菌體抗體庫(kù)，建立人源抗體制備技術(shù)平臺(tái)，為尋求惡性腫瘤的免疫治療新方法打下基礎(chǔ)。 方法：取4個(gè)健康獻(xiàn)血員新鮮血液各200ml，分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，以PCR擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈Fd段cD

3、NA。輕鏈PCR產(chǎn)物和噬粒載體pComb3經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ酶切，由T4DNA連接酶連接，電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，擴(kuò)增后提取噬粒，構(gòu)建輕鏈庫(kù)。輕鏈庫(kù)和重鏈Fd段PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和SpeⅠ酶切，以同樣方法連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13，產(chǎn)生噬菌體抗體全庫(kù)。提取噬粒酶切鑒定輕鏈庫(kù)和全庫(kù)有無(wú)插入片段。分別以噬菌體全庫(kù)和提取的噬粒為模板，以輕、重鏈不同引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建的抗體庫(kù)用人血白蛋