乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的基因組與轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、背景:
　　腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新能力的細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、耐藥過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的來源及本質(zhì)特征存在很大爭(zhēng)議，目前有以下幾種觀點(diǎn):第一，腫瘤細(xì)胞通過獲得某些突變成為腫瘤干細(xì)胞，從而獲得自我更新能力，也就是說腫瘤干細(xì)胞是一種可遺傳的內(nèi)在屬性。第二，腫瘤干細(xì)胞沒有明確的遺傳學(xué)變異，而是體現(xiàn)在一種轉(zhuǎn)錄組水平的可變性，即腫瘤細(xì)胞的可塑性?；诖?，本課題擬運(yùn)用基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和生物信息學(xué)方法，深入

2、闡明腫瘤于細(xì)胞的特性，明確其與非腫瘤干細(xì)胞的本質(zhì)差異。
　　乳腺癌發(fā)病率高，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，是研究腫瘤干細(xì)胞的良好疾病模型，明確乳腺癌腫瘤干細(xì)胞(Breast Cancer Stem Cells，BCSCs)的特性，可以為臨床靶向BCSCs治療開辟新思路。盡管針對(duì)BCSCs的相關(guān)研究已有報(bào)道，但是BCSCs的身份特性以及促使BCSCs形成的關(guān)鍵因素仍尚不清楚。鑒于此，本研究旨在揭示BCSCs自我更新能力是否由基因組水平突變決定

3、，以及通過對(duì)比乳腺癌腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞之間的基因組與轉(zhuǎn)錄組差異探明其內(nèi)在特點(diǎn)，從而為研發(fā)針對(duì)BCSCs的靶向藥物提供方向，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供策略。
　　方法:
　　(1)研究對(duì)象為乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231），應(yīng)用微球體連續(xù)傳代懸浮培養(yǎng)的方法富集BCSCs，并用ALDH1流式分選方法進(jìn)行鑒定。
　　(2)將收集的細(xì)胞樣品進(jìn)行全基因組測(cè)序(Whole Genome Sequencing，WGS)，對(duì)測(cè)序結(jié)

4、果得到的突變位點(diǎn)以及相關(guān)的變異頻率行滑動(dòng)窗口(sliding window)分析，檢測(cè)這些位點(diǎn)是否存在密集分布區(qū)域（hotspot區(qū)域，即最有可能包含BCSCs特異性突變位點(diǎn)的區(qū)域）。
　　(3)根據(jù)突變位點(diǎn)的分布特征，建立統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，應(yīng)用行程長(zhǎng)度編碼壓縮(Run-length encoding，RLE)算法，檢測(cè)hotspot區(qū)域。
　　(4)在群體細(xì)胞水平，對(duì)前面得到的hotspot區(qū)域行靶向深度測(cè)序，深入探究靶區(qū)內(nèi)基因

5、組水平突變信息是否為BCSCs特異性攜帶。
　　(5)進(jìn)行單細(xì)胞體外成球?qū)嶒?yàn)，收集單細(xì)胞來源的微球體（即BCSCs），以及不能成球的單細(xì)胞（即非乳腺癌腫瘤干細(xì)胞，non-BCSCs，NBCSCs），在單細(xì)胞水平利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增基因組信息，針對(duì)WGS中獲得的hotspot區(qū)域（命名為WHM靶區(qū)）以及數(shù)據(jù)庫中獲得的常見腫瘤熱點(diǎn)突變區(qū)域（命名為CHM靶區(qū)），同時(shí)進(jìn)行靶向深度測(cè)序。利用二項(xiàng)分布檢驗(yàn)，建立統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，逐一檢測(cè)

6、每個(gè)位點(diǎn)的基因組差異，并進(jìn)行隨機(jī)分組(permutation)，深入分析靶區(qū)內(nèi)基因組水平突變信息是否為BCSCs特異性攜帶。
　　(6)分離1000個(gè)左右的單細(xì)胞培養(yǎng)于微球體懸浮培養(yǎng)環(huán)境（1個(gè)細(xì)胞/孔），收集乳腺癌腫瘤于細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)，以明確單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平差異是否與BCSCs表型相關(guān)。

7、　　(7)生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)基因，明確BCSCs特異性高表達(dá)的(BCSCsHighly Expressed，BHE)基因，并在多次基于大量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　(8)針對(duì)BEE基因，進(jìn)行功能(Gene Ontology，GO)分析及STRING網(wǎng)絡(luò)富集分析，探討B(tài)HE基因的功能特征，及其作為BCSCs生物標(biāo)志物的可能性。
　　(9)利用TCGA(The Cancer Genome Altas)數(shù)據(jù)庫中多種

8、腫瘤類型的大樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討B(tài)HE基因是否具有臨床相關(guān)性，以及其作為BCSCs標(biāo)志物的可行性。
　　結(jié)果:
　　(1)大量群體細(xì)胞靶向深度測(cè)序揭示沒有BCSCs特異性攜帶突變位點(diǎn)的證據(jù)
　　1)ALDH1流式檢測(cè)結(jié)果顯示，在連續(xù)成球懸浮培養(yǎng)的過程中，從源生細(xì)胞(2D)至由此培養(yǎng)的第一代(SP1)、第二代(SP2)、第三代(SP3)、第四代微球體(SP4)，BCSCs的比例逐漸增高;
　　2)WGs結(jié)果

9、顯示，部分單核苷酸變異(Simple Nucleotide Variations，SNVs)的變異頻率(Variant Allele Frequency，VAF)在2D、SP1、SP4之間存在明顯差異。不同樣品間的VAF差異分析發(fā)現(xiàn)BCSCs潛在的特異性突變位點(diǎn);
　　3)滑動(dòng)窗口分析顯示，潛在BCSCs突變位點(diǎn)存在顯著的密集分布區(qū)域。進(jìn)一步分析顯示，這些位點(diǎn)呈現(xiàn)指數(shù)分布特征，利用RLE算法，尋找出54個(gè)潛在的特異性突變位點(diǎn)集中分

10、布的熱點(diǎn)區(qū)域(hotspot);
　　4)2D、SP1、SP4靶向hotspot的深度測(cè)序顯示，在測(cè)序深度顯著升高（平均每個(gè)位點(diǎn)覆蓋4500×）的情況下，2D、SP1、SP4樣品間靶區(qū)所有SNV位點(diǎn)的VAF沒有變化，該結(jié)果表明基因組水平突變決定BCSCs表型的假設(shè)不成立，并未發(fā)現(xiàn)BCSCs攜帶特異性突變位點(diǎn)的證據(jù)。
　　(2)單細(xì)胞靶向測(cè)序證實(shí)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞之間基因組水平無差異
　　1)單細(xì)胞水平靶向深

11、度測(cè)序結(jié)果顯示，平均測(cè)序深度為4000×?xí)r任意兩個(gè)樣品間靶區(qū)內(nèi)所有位點(diǎn)的堿基權(quán)重的相關(guān)系數(shù)非常高，并且相關(guān)系數(shù)在組間(BCSCs對(duì)比NBCSCs)與組內(nèi)（BCSCs對(duì)比BCSCs或者NBCSCs對(duì)比NBCSCs）比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值=0.3786);而且任意兩個(gè)樣品間的基因組距離極小（集中在0.001附近），說明所有樣品間基因組水平高度相似;
　　2)針對(duì)3個(gè)BCSCs的背景堿基數(shù)目與2個(gè)NBCSCs的噪音堿基數(shù)目進(jìn)行的二項(xiàng)分

12、布檢驗(yàn)顯示，WHM靶區(qū)內(nèi)有764個(gè)位點(diǎn)可能與BCSCs相關(guān);
　　3)針對(duì)這5個(gè)樣品進(jìn)行隨機(jī)分組結(jié)果顯示，檢測(cè)出的BCSCs相關(guān)突變位點(diǎn)數(shù)目與分組情況無關(guān)。隨著設(shè)定閾值從0.1逐漸降至0的過程中，真正分組與隨機(jī)組的檢測(cè)陽性位點(diǎn)數(shù)目均等比減少，兩者的比值呈現(xiàn)始終不變的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，BCSCs相關(guān)的潛在突變位點(diǎn)為假陽性，來源于測(cè)序噪音，BCSCs相對(duì)于NBCSCs沒有基因組水平的變異;
　　4)在CHM靶區(qū)，同樣證明BCS

13、Cs相對(duì)于NBCSCs無基因組水平變異。
　　(3)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示轉(zhuǎn)錄組水平的差異決定自我更新能力
　　1)體外單細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)顯示只有小部分單細(xì)胞生長(zhǎng)成為微球體，說明這部分細(xì)胞具有自我更新能力;
　　2)針對(duì)5個(gè)BCSCs與3個(gè)NBCSCs進(jìn)行單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Single Cell RNA sequencing，scRNA-seq)，并將2組表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA結(jié)果顯示，BCSCs組的表達(dá)譜相對(duì)于NBCS

14、Cs組，在“干細(xì)胞增殖調(diào)控”等干性相關(guān)功能的基因集中被顯著富集，提示單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平的差異與腫瘤干細(xì)胞表型密切相關(guān);
　　3)兩組間差異基因表達(dá)分析，篩選出74個(gè)在BCSCs中顯著高表達(dá)(BCSCs highly expressed，BHE)的基因，能夠決定BCSCs的自我更新能力。這74個(gè)基因的表達(dá)譜，在多次基于大量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與scRNA-seq結(jié)果之間呈現(xiàn)良好相關(guān)性，驗(yàn)證了seRNA-seq的檢測(cè)結(jié)果;
　　4)在

15、鑒定出的BHE基因中包含已報(bào)道的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因，如ALCAM、PKM、FASN、VEGFA、ADAM10、BCL2L1、CTGF、CTNNB1、PDLIM7、STS和SET。
　　(4)BHE基因可以作為BCSCs潛在的生物標(biāo)志物
　　1)BHE基因的功能(Gene Ontology，GO)分析顯示，BHE基因與胚胎發(fā)育、上皮細(xì)胞的遷移和細(xì)胞遷移的正向調(diào)控等功能顯著相關(guān);
　　2)功能網(wǎng)絡(luò)富集分析顯示BHE基因在生

16、物功能上具有相關(guān)性與協(xié)同性，如細(xì)胞生物學(xué)過程的正向調(diào)控（假陽性率:0.00295）和細(xì)胞表面受體信號(hào)通路（假陽性率:0.0034）;
　　3)TCGA數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤類型的大樣本患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，大部分BHE基因在癌與癌旁組織中呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的趨勢(shì)，具有臨床相關(guān)性，可以作為BCSCs的生物標(biāo)志物;
　　4)SurvExpress數(shù)據(jù)庫進(jìn)行1561名乳腺癌患者預(yù)后生存分析結(jié)果顯示，大部分BHE基因在乳腺癌復(fù)發(fā)高危組患者

17、中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)狀態(tài);
　　5)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫逐一進(jìn)行BHE基因的生存分析顯示，大部分基因與乳腺癌的不良預(yù)后呈現(xiàn)顯著相關(guān)性;
　　6)PRECOG數(shù)據(jù)庫評(píng)估BHE基因在不同腫瘤類型中的預(yù)后相關(guān)性，結(jié)果顯示BHE基因?qū)τ谏窠?jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后影響最大。
　　結(jié)論:
　　(1)在全基因組范圍內(nèi)，乳腺癌腫瘤干細(xì)胞相對(duì)于非腫瘤干細(xì)胞未攜帶特異性突變。
　　(2)BCSCs的身份特性及表型