衰老腸道微生態(tài)的變化及干預(yù)措施研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，我國已經(jīng)提前進入了人口老齡化社會，很多老年相關(guān)疾病和老年人的健康狀況得到了大家的關(guān)注。腸道微生態(tài)是指腸道菌群的組成，結(jié)構(gòu)，功能以及它們與宿主之間的相互作用，它在人體健康和一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都有重要的作用。隨著二代測序技術(shù)和各類組學(xué)的發(fā)展，研究人員對腸道微生態(tài)的了解也越來越多，在機體的整個生命過程中，腸道微生態(tài)并非一成不變的，它會受到生理狀況，生活習(xí)慣等多方面的影響，在衰老之后由于各種生理原因

2、，腸道微生態(tài)會發(fā)生一定變化，所以腸道微生態(tài)具有很大的可塑性，很有可能成為我們改善老年健康狀況，預(yù)防老年相關(guān)疾病的作用靶標(biāo)。
　　世界上已經(jīng)有一些關(guān)于衰老腸道菌群的研究，但是這些研究涉及到不同的國家和地區(qū)，且研究樣本的數(shù)量和年齡各有不同，采用的研究方法也不盡相同，所以得出的結(jié)論并不統(tǒng)一，對于衰老之后腸道菌群的變化規(guī)律并無定論，另外在這些研究中并沒有我國衰老腸道菌群的大樣本研究。所以本文的主要研究目的是研究我國衰老人群的腸道菌群變化，

3、進而用小鼠作為模型，研究改善衰老腸道微生態(tài)的方法。
　　為了研究衰老人群腸道菌群的變化，我們在我國河南省采集了102份糞便標(biāo)本，其中包括59名老年人（男29,女30），平均年齡為77.6歲；15名中年人（男10,女5），平均年齡為48歲；還有28名年輕人（男18,女10），平均年齡為32歲。利用16s高通量測序的方法檢測其腸道菌群，在菌門水平下，3組人群中，擬桿菌門和厚壁菌門均為最主要的兩個菌門，占據(jù)整體菌群的80％以上，其中又以

4、擬桿菌門含量最多，在老年組中，擬桿菌門為52.4%,厚壁菌門為27.9%；在中年組中擬桿菌門為55.2%,厚壁菌門為31.7%；在年輕人組中，擬桿菌門為49.2%,厚壁菌門為36.2%。變形菌門含量僅次于上述兩大菌門，在老年組、中年組和年輕人組中分別為17.7%、11.1%和12.0%。以上菌門的組成與已有數(shù)據(jù)報道的國家相比，都有不同之處。衰老之后的腸道菌群變化趨勢為擬桿菌門的含量隨著年齡的增長逐漸增多，厚壁菌門含量降低，厚壁菌門/擬桿

5、菌門的比值在年輕人組、中年組和老年組中分別為0.73、0.57和0.53，逐漸降低，更能直觀地反映這種變化趨勢。在整體的菌群結(jié)構(gòu)中，我們采用了Beta多樣性分析中的PCoA分析和NMDS分析來顯示衰老腸道菌群的變化，在這兩個分析中都顯示，代表老年組和年輕人組的點距離較遠，說明它們之間的整體菌群組成差別較大， 老年組之中，樣本與樣本之間離散度較高，而年輕人組中標(biāo)本之間距離較近，比較集中，說明老年組組間差異較大，而年輕人組組間差異

6、較小。為了進一步探討具體菌屬的差異，我們又進行了組間顯著性差異metastats分析，分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)丁酸鹽的細菌在老年人組及年輕人組之中含量差別較大，F(xiàn)aecalibacterium菌屬和Roseburia菌屬在老年組中顯著低于年輕人組，產(chǎn)乙酸和乳酸的Gemella菌屬和產(chǎn)丙酸的Propionibacterium菌屬也在老年組中降低。但以往認為在老年人中會降低的雙歧桿菌（Bifidobacterium）菌屬，在我們的研究中老年組和年輕組中并

7、沒有明顯差異，另外Akkermansia菌屬在老年組中的含量要高于年輕人組，這種菌屬與人類機體的代謝及相關(guān)健康狀況有關(guān)。
　　在用BALB/c小鼠作為模型研究衰老腸道微生態(tài)的干預(yù)措施時，我們選取了富含支鏈氨基酸的氨基酸混合物（BCAAem）作為干預(yù)措施，分別研究了其對衰老小鼠腸道菌群，糞便上清代謝組學(xué)及機體免疫狀況的影響。干預(yù)的時間為小鼠11月齡到15月齡，即相當(dāng)于從中年期到老年期，在衰老小鼠腸道菌群的研究中， BCAAem喂養(yǎng)組

8、腸道菌群的豐富度高于對照組，且BCAAem喂養(yǎng)組在整體的菌群結(jié)構(gòu)上也與對照組不同。小鼠的腸道菌群仍然以擬桿菌門和厚壁菌門為主，兩者占據(jù)了全部菌群的95%以上，其中擬桿菌門為含量最高的菌門，均在50%以上，而厚壁菌門約為45%左右。在11月齡時，對照組擬桿菌門含量為51.37%，BCAAem喂養(yǎng)組為51.68%，對照組厚壁菌門為46.24%，BCAAem喂養(yǎng)組為44.91%；而在15月齡時，對照組擬桿菌門含量為59.64%，BCAAem喂

9、養(yǎng)組為55.85%，對照組厚壁菌門為38.16%，BCAAem喂養(yǎng)組為41.78%。隨著年齡的增長小鼠的擬桿菌門含量逐漸增多，而厚壁菌門的含量逐漸降低，與我們所做人體的腸道菌群變化趨勢類似。在對照組中，隨著年齡的增長，擬桿菌門的含量增長了8.27%，而厚壁菌門下降了8.08%；在BCAAem喂養(yǎng)組中，擬桿菌門的含量增長了4.17%，而厚壁菌門下降了3.13%。BCAAem的喂養(yǎng)延緩了腸道菌群由于年齡而變化的趨勢，這一趨勢可以在厚壁菌門/

10、擬桿菌門的比值中觀察的更清楚，在對照組中，厚壁菌門/擬桿菌門的比值在11月齡時為0.90，而在15月齡時為0.64；在BCAAem喂養(yǎng)組中，厚壁菌門/擬桿菌門的比值在11月齡時為0.87，而在15月齡時為0.75。變形菌門為含量第三大的菌門，在15月齡時，對照組的變形菌門含量顯著高于BCAAem喂養(yǎng)組，約為后者的兩倍，變形菌門中含有一些致病菌，如腸桿菌，這些腸桿菌可以在特定的環(huán)境中導(dǎo)致感染而致病，說明BCAAem的喂養(yǎng)可以降低腸道中變形

11、菌門的含量，從而能起到一定的改善腸道健康的作用。為了驗證16s高通量測序的準(zhǔn)確性和檢測含量極低的細菌，我們對Bifidobacterium，Lactobacillus，Clostridium leptum和Prevotella這四類細菌進行了熒光定量PCR的檢測，Bifidobacterium無論是在對照組還是BCAAem喂養(yǎng)組， 隨著年齡的增長，其含量都呈現(xiàn)出一個降低的趨勢，但是在BCAAem喂養(yǎng)組中，Bifidobacte

12、rium降低的趨勢比較平緩，且在14月齡和15月齡時Bifidobacterium的含量要高于對照組，說明喂養(yǎng)BCAAem后，可以增加腸道內(nèi)Bifidobacterium的含量。Lactobacillus和Prevotella菌屬在兩組之間差異不大，Clostridium leptum在對照組和BCAAem喂養(yǎng)組，隨著年齡的增長，其含量都有一定的增加，其中在BCAAem喂養(yǎng)組中增加的量較多，而且對比15月齡時的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，BCAAem喂養(yǎng)

13、組要高于對照組。
　　在對機體腸道的免疫狀況進行研究時，我們檢測了小鼠糞便上清中的兩種促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β，以及一種抗炎性細胞因子IL-10。結(jié)果顯示在15月齡時，對照組的TNF-α濃度平均值為57.6pg/ml，而BCAAem喂養(yǎng)組的平均值為46.1pg/ml；對照組IL-1β的濃度平均值為182.0pg/ml，而在BCAAem喂養(yǎng)組中濃度的平均值為158.3pg/ml，TNF-α和IL-1β在BCAAem喂養(yǎng)組

14、中濃度低于對照組。而IL-10在15月齡對照組中的濃度平均值為34.6pg/ml，在BCAAem喂養(yǎng)組中濃度的平均值為96.2 pg/ml，BCAAem喂養(yǎng)組高于對照組。另外我們還檢測了可以反映機體免疫負載的脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP），在小鼠15月齡時，BCAAem喂養(yǎng)組中，LBP的含量為20.3pg/ml，而對照組為39.7pg/ml，BCAAem喂養(yǎng)組LBP的濃度是

15、明顯低于對照組的。以上結(jié)果均說明BCAAem的喂養(yǎng)可以降低腸道的炎癥反應(yīng)和免疫抗原的負載，從而改善整個機體的免疫狀況。
　　在糞便上清代謝組學(xué)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)BCAAem喂養(yǎng)組和對照組在代謝產(chǎn)物的組成上有明顯差異，差異代謝物有十八碳烯酸，膽固醇，油酸，脫氧膽酸，丙三醇，果糖，蔗糖，赤藻糖醇，油酸甘油酯，木糖醇，苯乳酸，豆甾醇。其中在BCAAem喂養(yǎng)組中相對升高的是十八碳烯酸，膽固醇，油酸，脫氧膽酸，丙三醇，而相對降低的是果糖，蔗

16、糖，赤藻糖醇，油酸甘油酯，木糖醇，苯乳酸，豆甾醇，兩組中差別較大的多是與脂類代謝和糖代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物。所以，BCAAem的喂養(yǎng)使整個糞便的代謝物組成發(fā)生了變化，而其中脂類代謝和糖代謝是變化較多的部分，這些差異物為深入研究BCAAem的喂養(yǎng)對腸道代謝造成的影響奠定基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本課題首次大樣本研究了我國衰老人群腸道菌群的變化，整體結(jié)構(gòu)和菌群各分類水平均與年輕人有不同之處。又利用小鼠模型首次探討了BCAAem這一干預(yù)措施對衰