肝硬化門脈高壓大鼠腸道微生態(tài)狀況的變化及其相關干預的實驗研究.pdf

1、肝病狀態(tài)下，尤其在肝硬化門脈高壓時，患者常出現(xiàn)如惡心、嘔吐、胃納明顯下降等癥狀，相對而言，腸道菌群營養(yǎng)底物缺乏；肝功能受損其合成能力下降，血漿中的白蛋白水平急聚降低，因而易產生腹水；膽汁分泌不足，腸道內膽鹽缺乏；肝臟結構改變，肝硬化門脈高壓形成，胃、腸血管動靜脈短路開放，血管被動瘀血和主動充血，血管血容量增加，血流瘀滯、組織缺氧，出現(xiàn)門脈高壓性胃病及腸??；臨床上為防止消化道出血、感染，預防性或治療性應用抑酸藥物如洛賽克和抗生素等。以上因

2、素的存在均可導致腸道微生態(tài)失調。表現(xiàn)為專性厭氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著減少，而革蘭陰性桿菌（GNR）顯著增多，存在腸道GNR過度性生長、腸管擴張、腸壁變薄等情況。這種失調出現(xiàn)于整個腸道，且腸道微生態(tài)失衡程度與肝硬化門脈高壓的嚴重程度相關，并隨肝功能出現(xiàn)好轉而逐漸恢復。腸道微生態(tài)失調，腸道定植抗力下降及腸道屏障功能受損是其腸道內毒素移位、內毒素血癥形成的原因之一。業(yè)已證明，嚴重肝病時都存在內毒素血癥，其發(fā)生率約為58%一100%。內毒素及

3、由內毒素刺激機體產生的TNF-a、IL-1等細胞因子可引起肝細胞凋亡、壞死，加重肝臟原有的損傷。腸道菌群恢復時可以降低門靜脈內毒素，但是大鼠腸道內毒素的下降要晚于腸道菌群的恢復。隨著肝硬化門脈高壓病情的惡化，可出現(xiàn)各種并發(fā)癥，其中與腸道微生態(tài)有密切關系的有繼發(fā)性細菌感染、內毒素血癥、上消化道出血等。因此，在治療肝硬化門脈高壓癥時，尚需從腸道微生態(tài)的角度加以對其并發(fā)癥的防治。消化道出血歷來是外科研究和治療的重點。門脈高壓性胃病、門脈高壓性

4、腸病等所致的消化道出血、貧血、消化吸收不良、菌群失調和感染等病癥相對缺乏防、治經(jīng)驗。本研究：
　　 目的：
　　 1、構建穩(wěn)定、可靠的肝硬化門脈高壓大鼠動物模型，研究該模型肝臟及腸道病變情況。
　　 2、研究肝硬化門脈高壓大鼠菌群移位、腸道微生態(tài)、腸黏膜屏障功能及內毒素血癥等改變，并探討TNF-α、對Occludin蛋白以及腸黏膜屏障功能的影響，在腸源性內毒素血癥發(fā)病機制中的作用。
　　 3、研究微

5、生態(tài)制劑-乳果糖在調節(jié)門脈高壓大鼠腸道菌群失調、抑制菌群移位、改善內毒素血癥進而改善肝功能的作用，探討其在肝硬化門脈高壓治療中的作用機制。
　　 4、研究微生態(tài)制劑-乳果糖對行脾切除+選擇性斷流術后門脈高壓大鼠腸道微生態(tài)狀況的影響，探討其在門脈高壓癥外科治療中的意義。
　　 方法：
　　 1、肝硬化門脈高壓大鼠動物模型建立：按0.4 ml/100g劑量予以背部皮下注射50% CCL4橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)

6、4周，第5周開始改以0.5ml/100g標準背部皮下注射，每周2次，持續(xù)4周，模型制作共10周。行上腹部CT、MR掃描，觀察肝硬化、脾腫大、腹水等情況；以HE染色、Masson三色染色、透射電鏡觀察大鼠肝臟及腸組織病變情況；測量門靜脈直徑和門靜脈壓力以了解該模型血液動力學變化情況。
　　 2、電鏡觀察腸上皮細胞緊密連接超微結構和絨毛病變；檢測細菌易位率；分析腸道菌群構成情況并作菌種DNA指紋圖譜分析；做肝功能測定；采用改良的偶

7、氮基質顯色法行內毒素測定；采用免疫組織化學方法和Western blot法分別測定其末段回腸和結腸的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）及緊密連接蛋白（Occludin）表達水平。
　　 3、對門脈高壓模型大鼠進行乳果糖干預治療即：每日灌服乳果糖(67%)5ml/kg，每日2次，直至大鼠排稀便，研究其腸黏膜通透性及腸微生態(tài)改變，檢測細菌移位、肝功能、內毒素血癥情況。
　　 4、將門

8、脈高壓大鼠行“脾切除加選擇性賁門周圍血管離斷術”后，應用乳果糖干預治療，研究其腸黏膜通透性及腸微生態(tài)改變，檢測細菌移位、肝功能、內毒素血癥情況。
　　 結果：
　　 1、復合法四氯化碳大鼠門脈高壓模型，死亡率28％；四氯化碳用藥10周后見大鼠體形消瘦，CT檢查示肝臟體積縮小，脾臟略有增大，伴有肝周少量腹水；病理切片見肝內假小葉廣泛形成，假小葉內可見纖維再分割現(xiàn)象，同時伴有明顯的肝細胞再生結節(jié)；開腹穿刺測壓結果：對照組（

9、7.62±2.02）mmHg、實驗組（15.76±2.68）mmHg，兩組比較具有顯著性差異（P<0.05）。表明存在肝硬化門靜脈高壓表現(xiàn)。
　　 2、門脈高壓組細菌易位發(fā)生率較正常對照組明顯增高（P<0.05），乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量則顯著減少（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則明顯增多（P<0.01）；門脈高壓組肝功能各項（AST、ALT、TBLL、ALB）叫正常組均明顯惡化（P<0.01），其血清內毒素水平（0.44

10、±0.07Eu/ml）亦明顯高于正常組之（0.20±0.08Eu/ml）（P<0.01）；回、結腸的緊密連接蛋白Occludin及TNF-α表達，兩組比較具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 3、應用乳果糖干預后，門脈高壓治療對照組（A組）細菌易位發(fā)生率較乳果糖組（B組）和正常對照（C組）均明顯增高（P<0.05）；B組及C組乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量均較A組增多（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則顯著降低（P<0.01）；

11、A組細菌DNA指紋圖譜條帶明顯減少，且出現(xiàn)異常條帶，B組腸道內優(yōu)勢菌群的基因條帶與C組具有高度一致性；與B、C組比較，A組肝功能各項（AST、ALT、TBLL、ALB）均明顯惡化（P<0.01）；A組血清內毒素水平（0.44±0.07Eu/ml）亦明顯高于B、C組之（0.33±0.06Eu/ml）、（0.20±0.08Eu/ml）（P<0.01）；回、結腸的緊密連接蛋白及TNF-α表達，A組與B、C組比較，具有顯著性差異（P<0.01）

12、。
　　 4、行“脾切除加選擇性賁門周圍血管離斷術”后門脈高壓大鼠，應用乳果糖干預治療。術后治療對照組（PC組）細菌易位發(fā)生率較術后乳果糖組（PB組）和假手術組（PD組）均明顯增高（P<0.05）；PB組及PD組乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量均較PC組增多（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則顯著降低（P<0.01）；PC組細菌DNA指紋圖譜條帶明顯減少，B組腸道內優(yōu)勢菌群的基因條帶與術前治療組（A組）、PD組無明顯差異；與PB、P

13、D組比較，PC組肝功能各項（AST、ALT、TBLL）均明顯升高（P<0.01），而血清白蛋白（ALB）則顯著降低（P<0.01）；PC組血清內毒素水平（0.51±0.08Eu/ml）亦明顯高于PB、PD組之（0.31±0.09Eu/ml）、（0.34±0.09Eu/ml）（P<0.01）；回、結腸的緊密連接蛋白及TNF-α表達，PC組與PB、PD組比較，具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 結論：
　　 我們應用四氯

14、化碳橄欖油復合法所構建的動物模型其組織學改變與人類肝硬變相似，門靜脈壓力顯著增高并產生一定程度的門體交通支分流，是研究門脈高壓癥的理想模型。
　　 門脈高壓大鼠隨著病變的進展，存在著明顯的腸黏膜屏障功能障礙，通透性升高，出現(xiàn)腸道微生態(tài)紊亂，菌群失調，菌群移位和腸源性內毒素血癥，同時肝功能損害加劇。
　　 微生態(tài)制劑乳果糖可以明顯改善門脈高壓大鼠腸道的微生態(tài)，可促進有益菌的生長從而提高定植抗力，并籍此抑制潛在致病菌生長及其