慢加急肝衰竭腸道菌群與系統(tǒng)免疫相關(guān)性的初步探討——慢加急肝衰竭(ACLF)不同時(shí)期腸道菌群、血漿內(nèi)毒素、宿主系統(tǒng)免疫的動(dòng)態(tài)變化及其相關(guān)性的初步探討.pdf

1、乙肝病毒引起的慢加急肝衰竭在我國并不罕見，以病理上肝細(xì)胞的大塊或橋接壞死為特征，同時(shí)出現(xiàn)血膽紅素水平升高、凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率高。肝臟與胃腸道的關(guān)系甚為密切，人類的腸道定植了大概400種不同的菌種，總數(shù)達(dá)1014，主要包括對(duì)人體有益的“共生菌”及在一般情況下不致病的“中間菌群”。腸道菌群促進(jìn)了機(jī)體物理和免疫屏障的成熟，對(duì)人體的代謝、腸道局部或全身免疫有重要影響。大量研究證實(shí)，嚴(yán)重的肝臟功能損害，如肝硬化，可以導(dǎo)致胃腸道菌群失衡及內(nèi)毒

2、素血癥等一系列改變。腸道菌群是一個(gè)整體，是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的組成部分，因此，其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響是綜合性的。在腸道菌群與機(jī)體免疫相互關(guān)系的研究中，大多只是著眼于某一種菌群，或者為局部免疫，幾乎沒有腸道菌群整體對(duì)全身性免疫影響的研究。有動(dòng)物模型及臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝衰竭時(shí)存在腸道菌群失衡及內(nèi)毒素血癥，腸球菌、腸桿菌增多，雙歧桿菌減少等。慢加急肝衰竭(ACLF)病情重，病程遷延，在病情不斷進(jìn)展變化中，腸道菌群的失衡狀態(tài)是否一成不變，機(jī)體免疫改變?nèi)?/p>

3、何，二者之間是否存在關(guān)聯(lián)，尚無研究闡明。
　　 本研究旨在根據(jù)慢加急肝衰竭(ACLF)病情變化，動(dòng)態(tài)觀察腸道菌群、宿主系統(tǒng)免疫的變化，從基礎(chǔ)免疫學(xué)方面探究與腸道菌群之間的關(guān)系，希望找到二者之間的變化規(guī)律，從而為進(jìn)一步探尋分子機(jī)制提供依據(jù)，并為臨床治療提供新的思路及方法。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：慢加急肝衰竭(ACLF)不同時(shí)期腸道菌群、血漿內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)變化及其與肝功能關(guān)系的研究。
　　 方法：動(dòng)態(tài)收集2

4、008年10月至2009年4月于我科住院的30例HBV感染引起的慢加急肝衰竭病人的大便標(biāo)本及血標(biāo)本(2種標(biāo)本必須在同一天內(nèi)收集)，每2周1次，當(dāng)膽紅素開始下降后，再收集2次。糞便標(biāo)本在收集后行6種腸道優(yōu)勢(shì)菌群(需氧菌：腸球菌、腸桿菌、真菌。厭氧菌：乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌)培養(yǎng)，血標(biāo)本以肝素鈉抗凝管收集，無菌分離血漿后-80℃保存，統(tǒng)一行血漿內(nèi)毒素檢測(cè)，并收集臨床上轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、凝血酶原時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果。健康對(duì)照組20例，行腸道菌群培

5、養(yǎng)及血漿內(nèi)毒素水平檢測(cè)。
　　 結(jié)果：㈠根據(jù)血總膽紅素的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，將慢加急肝衰竭(ACLF)分為3期：(1)極期：當(dāng)血TBIL達(dá)最高值，一般是在起病開始的第5周(中位時(shí)間是第31天)。(2)進(jìn)展期：從起病開始至血總膽紅素最高的一段時(shí)間，TBIL上升迅速，平均每天約15.22umol/l。(3)緩解期：血總膽紅素開始下降時(shí)開始，以后的時(shí)期，平均每天下降約7.88umol/l大多數(shù)病人在第12~16周血漿TBIL下降至100um

6、l/L以下。㈡從ACLF的整個(gè)病程來看，與健康組相比，腸球菌、腸桿菌、真菌、總厭氧菌增多(P＜0.05)，乳酸桿菌、雙歧桿菌明顯減少(P＜0.05)，類桿菌無明顯變化。㈢不同時(shí)期，腸道菌群不同，變化主要表現(xiàn)在球、桿菌方面。與進(jìn)展期相比，極期時(shí)腸球菌進(jìn)一步過度生長(zhǎng)，腸桿菌有所減少。緩解期，腸球菌數(shù)目有所回落，腸桿菌數(shù)目較前增多，但仍高于健康組。㈣從ACLF整個(gè)病程來看，其血漿內(nèi)毒素水平(0.04(0.01~0.19))明顯高于健康組(0.

7、03±0.02)(p=0.022)。且在ACLF不同時(shí)期，血漿內(nèi)毒素水平也呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，極期達(dá)最高水平(0.10±0.05)，緩解期有所降低(0.03±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。㈤ACLF病人血漿內(nèi)毒素水平與腸球菌正相關(guān)(r=0.361，p=0.022)，與球桿比值也成正相關(guān)(r=0.386，p=0.013)。㈥ACLF病人血漿LPS與血IBIL正相關(guān)(r=0.334，P=0.035)，與TBIL，DBIL，AST，ALT，PT，P

8、TA無明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論：⑴腸道菌群失衡及血漿內(nèi)毒素在ACLF不同時(shí)期動(dòng)態(tài)變化。⑵腸道菌群失衡越嚴(yán)重，血漿內(nèi)毒素水平也越高。⑶在ACLF病人中，血漿內(nèi)毒素與腸球菌正相關(guān)。⑷在ACLF病人中，血漿內(nèi)毒素與血IBIL正相關(guān)。
　　 第二部分：慢加急肝衰竭(ACLF)不同時(shí)期腸道菌群、系統(tǒng)免疫的動(dòng)態(tài)變化及其相關(guān)性的探討。
　　 方法：按第一章方法收集慢加急肝衰竭(ACLF)組糞便標(biāo)本及血標(biāo)本(與第一章為同一組病人

9、，故糞便標(biāo)本、血標(biāo)本與第一章為同一標(biāo)本)。行腸道優(yōu)勢(shì)菌群培養(yǎng)、血漿內(nèi)毒素及臨床肝功能指標(biāo)檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)非特異性免疫及特異性免疫指標(biāo)。收集血清，-20℃保存，統(tǒng)一行細(xì)胞因子檢測(cè)(ELISA法)。血標(biāo)本收集4小時(shí)內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞表面CD3，CD19，CD4，CD8，CD25，CD127的表達(dá)(全血細(xì)胞裂解法，流式細(xì)胞術(shù))，Th1、Th2及Th1/Th2比值測(cè)定(三色法，流式細(xì)胞術(shù))。血標(biāo)本24小時(shí)內(nèi)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，以植物血凝素(

10、PHA，10ug/ml)、脂多糖(LPS，2.5ug/ml)為刺激劑培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞增殖度(CCK-8法)。健康組10人，檢測(cè)指標(biāo)同ACLF組。
　　 結(jié)果：⑴腸道菌群培養(yǎng)、血漿內(nèi)毒素檢測(cè)及肝功能指標(biāo)結(jié)果與第一章數(shù)值略有不同，但各P值相同。⑵ACLF整個(gè)病程及各期的IL-6、IL-10水平均高于健康組，菌群失衡動(dòng)態(tài)變化加重時(shí)，IL-6、IL-10無明顯變化。TGB-β水平與健康組差別并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β和TNF-α表

11、達(dá)低于檢測(cè)水平。各種細(xì)胞因子濃度與血漿內(nèi)毒素水平均無相關(guān)性。⑶從ACLF整個(gè)病程來看，單核細(xì)胞的比例與健康組無差別，但不同時(shí)期卻呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)展期高于健康組，在極期明顯下降，低于至健康人水平，在緩解期比例再次升高，但仍低于健康組(p＜0.05)。未發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞比例與血漿內(nèi)毒素水平有相關(guān)性。⑷從ACLF整個(gè)病程來看，CD19 B細(xì)胞比例平均水平高于健康組，不同時(shí)期呈現(xiàn)明顯的動(dòng)態(tài)變化，極期較進(jìn)展期升高，達(dá)到峰值，在緩解期降至健康組水平。在

12、緩解期，CD19 B細(xì)胞比例與血漿內(nèi)毒素水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.689，p=0.027)。⑸ACLF整個(gè)病程及各不同時(shí)期CD3比例均高于健康組，不同時(shí)期呈動(dòng)態(tài)變化，于極期時(shí)最低，緩解期較極期升高。從ACLF整個(gè)病程來看，CD3+細(xì)胞與血漿內(nèi)毒素負(fù)相關(guān)(r=-0.468，p=0.002)。⑹ACLF整個(gè)病程及各個(gè)不同時(shí)期與健康組相比，外周血Th2細(xì)胞及Th1/Th2比值均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且不呈動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)展期，血漿內(nèi)毒素與Th2正相

13、關(guān)(r=0.675，p=0.046)，與Th1負(fù)相關(guān)(r=-0.782，p=0.013)，在極期、緩解期，內(nèi)毒素與Th2負(fù)相關(guān)(r1=-0.813，p1=0.049；r2=-0.817，p=0.007)。⑺ACLF組PHA刺激后，增殖度與健康組相比無差異，且無動(dòng)態(tài)變化。LPS刺激后，細(xì)胞增殖度與血漿內(nèi)毒素水平正相關(guān)(r=0.364，p=0.042)，且在緩解期細(xì)胞增殖明顯受抑制。
　　 結(jié)論：①腸道菌群、血漿內(nèi)毒素水平及機(jī)體免疫