單葉鐵線蓮總皂苷提取、純化工藝及抗類風濕關節(jié)炎的初步研究.pdf

1、一、目的
　　 建立單葉鐵線蓮總皂苷(TsCH)TsCH的含量測定方法,研究適宜TsCH提取和純化的工藝條件,考察TsCH的抗炎活性及作用機制,充分利用單葉鐵線蓮資源,開發(fā)以TsCH為主要成分治療類風濕關節(jié)炎的中藥新藥。
　　 二、方法
　　 1.TsCH的含量測定:選用齊墩果酸為對照品,采用比色法,以5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸為顯色劑,在550nm處測定吸光度。以齊墩果酸的量(mg)為橫坐標,以吸光度(A)

2、為縱坐標,制作標準曲線,計算得回歸方程,進行方法學考察。
　　 2.TsCH微波提取工藝:以TsCH轉移率為指標,將微波提取法與加熱回流提取法及超聲提取法進行比較;在單因素實驗的基礎上,運用正交實驗設計,篩選最佳微波提取工藝。
　　 3.TsCH的純化工藝:采用靜態(tài)吸附-解吸和動態(tài)吸附-洗脫考察相結合的方法,篩選5種不同性質(zhì)的大孔樹脂;根據(jù)篩選出來的樹脂進行動態(tài)吸附洗脫參數(shù)的考察。
　　 4.TsCH對類風濕關節(jié)

3、炎大鼠作用的考察:雌性SD大鼠48只,隨機分為5組:正常對照組,模型對照組,陽性對照(甲氨蝶呤,1 mg·kg-1·w-1)組,TsCH高、低劑量組(150、50mg·kg-1·d-1)。除正常對照組外,其余注射Ⅱ型膠原造模。灌胃給藥,持續(xù)5周,觀察動物一般情況及體重,測定足趾容積和厚度。5周后處死動物,腹主動脈采血測定血清中免疫球蛋白G(IgG)、白介素-1β(IL1-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量;取大鼠踝關節(jié)組織切片,檢查

4、關節(jié)組織病理學。
　　 三、結果
　　 1.TsCH的含量:測定所得回歸方程為Y=3.5913X+0.0077,相關系數(shù)R2=0.9994,線性范圍0.036～0.216 mg。以此計算TsCH的含量。方法學實驗結果顯示,顯色在120min內(nèi)吸收值穩(wěn)定,RSD為1.97％,精密度和重復性良好,RSD分別1.04％和3.11％;平均回收率為97.90％(n=9),RSD為2.08％。
　　 2.TsCH微波提取工藝

5、結果表明,以70％乙醇為提取溶劑,微波功率300W,料液比1:26,提取3次,每次提取6 min,TsCH的轉移率可達95％左右。
　　 3.TsCH的純化工藝:根據(jù)靜態(tài)吸附、洗脫實驗初步確立了D-101型大孔樹脂為分離TsCH的樹脂,動態(tài)考察所得純化工藝參數(shù)為:上樣濃度為0.2 g生藥·mL-1,pH值為5,以1 BV/h的流速上樣,4 BV蒸餾水2 BV/h的流速洗脫雜質(zhì),4 BV70％乙醇以2 BV/h的流速洗脫總皂苷。研

6、究結果表明,未純化前總固物中總皂苷的含量為29.95％,純化后總固物中的TsCH含量為71.56％,精制度達238.92％,轉移率達到86.03％。
　　 4.TsCH對類風濕關節(jié)炎大鼠作用的考察觀察:TsCH對Ⅱ型膠原誘導關節(jié)炎大鼠的影響。結果發(fā)現(xiàn),注射Ⅱ型膠原兩次,21天后造模成功。與模型組相比,TsCH能明顯降低關節(jié)炎指數(shù)評分,減小足趾容積,足趾厚度有降低趨勢;能降低血清中IgG、IL1-β、TNF-α水平;關節(jié)組織病理學