ITGB4BP對創(chuàng)面修復中成纖維細胞的影響及其相關機制研究.pdf

1、增生性瘢痕是皮膚真皮層受到嚴重創(chuàng)傷后的一種病理性愈合，產(chǎn)生的瘢痕及其攣縮不僅影響了患者的容貌，還能導致受傷部位功能障礙，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。雖然近60年來得益于治療手段的不斷提高，大多數(shù)燒傷、創(chuàng)傷患者的生命得以挽救，但由于創(chuàng)面愈合晚期形成的增生性瘢痕的發(fā)病機理尚未完全明了，因此無論是外科手術還是藥物治療對于增生性瘢痕仍無明顯療效。因此深入研究增生性瘢痕形成的機制，尋找增生性瘢痕產(chǎn)生的相關特異性基因是目前創(chuàng)傷外科研究領域的熱點、重點

2、、難點問題之一。
　　 皮膚創(chuàng)傷后，創(chuàng)周出現(xiàn)缺血缺氧、炎癥反應，創(chuàng)周微環(huán)境改變，在以TGF-β1為主的細胞因子和機械應力的作用下，創(chuàng)周靜息成纖維細胞向具有收縮功能的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。在創(chuàng)面正常愈合中，肌成纖維細胞逐漸凋亡，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解，但是在增生性瘢痕愈合中肌成纖維細胞凋亡受到抑制而持續(xù)存在，活化的成纖維細胞和肌成纖維細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)，造成膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度

3、沉積和膠原纖維排列紊亂，細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解失衡，同時肌成纖維細胞的α-平滑肌肌動蛋白能導致創(chuàng)面收縮引起功能障礙。
　　 目前治療增生性瘢痕主要是通過控制瘢痕中過多基因或蛋白的表達等方式，但尚未取得顯著療效。因此我們逆向思考，是否可以尋找瘢痕中表達下降的基因或蛋白，通過增加其表達，實現(xiàn)更好的控制瘢痕形成的目的。尋找的策略是瘢痕中高表達的基因或蛋白抑制了在正常情況下高表達的基因或蛋白(即與正常皮膚組織比較，瘢痕中低表達或不表達的

4、基因或蛋白)，而此被抑制的基因或蛋白正是控制正常皮膚組織不轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾择：鄣年P鍵因素；并進一步設想，該低表達的基因或蛋白是與瘢痕中高表達的基因產(chǎn)物有關聯(lián)的。為此，我們對增生性瘢痕和正常皮膚內(nèi)的差異表達基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)P311基因高表達于新生的增生性瘢痕內(nèi)，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，是促進增生性瘢痕形成的關鍵基因之一。因此，我們以P311為切入點，尋找與其相互作用的、但在瘢痕組織中低表達或不表達的基因或蛋白。通過酵母雙雜交技術和

5、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)技術篩選出P311的相互作用蛋白：整合素β4結(jié)合蛋白(Integrin beta4 binding protein，ITGB4BP)。ITGB4BP，又名真核啟動因子6(eIF6)、p27BBP，能與整合素β4(ITGB4)胞漿區(qū)發(fā)生相互作用。研究發(fā)現(xiàn)：一方面ITGB4BP作為真核起始因子參與調(diào)節(jié)核糖體40s和60s的結(jié)合形成80s

6、亞基，也能參與RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成而調(diào)控mRNA的降解；另一方面，ITGB4BP參與調(diào)節(jié)Wnt信號通路中的β-catenin的表達，通過影響細胞骨架和粘附發(fā)揮調(diào)控細胞分化的作用。因此，一方面ITGB4BP可能通過下調(diào)促瘢痕形成相關基因和蛋白達到抑制瘢痕形成的目的；另一方面ITGB4BP也可能通過調(diào)控細胞骨架和粘附，影響細胞應力的感知而抑制肌成纖維細胞的形成。在

7、此基礎上，我們進行了系統(tǒng)的研究，主要涉及以下三個方面：1)ITGB4BP基因和蛋白在不同來源的成纖維細胞和不同組織中的差異表達；2)通過體外試驗：在增生性瘢痕來源的成纖維細胞中強制高表達ITGB4BP后，觀察靶細胞在該基因作用下的功能變化及其可能的分子信號通路；3)通過在體纖維化疾病模型，觀察ITGB4BP對不同組織纖維化的影響。
　　 1、ITGB4BP低表達于增生性瘢痕來源的成纖維細胞
　　 我們首先收集了燒傷后增生

8、性瘢痕組織和其同體對照正常皮膚組織進行原代分離、培養(yǎng)獲得了增生性瘢痕來源的成纖維細胞和正常皮膚來源的成纖維細胞，然后利用Real-Time PCR技術和Western Blotting技術分別從mRNA水平和蛋白水平檢測了增生性瘢痕來源的成纖維細胞和正常皮膚來源的成纖維細胞中ITGB4BP的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB4BP基因無論是mRNA水平還是蛋白水平均低表達于增生性瘢痕來源的成纖維細胞。
　　 同時我們檢測了正常成人皮膚和增生

9、性瘢痕皮膚中ITGB4BP的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在正常成人皮膚和增生性瘢痕皮膚中ITGB4BP主要表達在表皮層的基底細胞的胞漿中，同時ITGB4BP在正常皮膚真皮層的成纖維細胞中也有表達，主要分布在細胞胞漿中，但在增生性瘢痕皮膚真皮層成纖維細胞中卻未見明顯陽性細胞的表達。因此提示胞漿ITGB4BP(+)的成纖維細胞是生理成纖維細胞，而胞漿ITGB4BP(-)細胞是纖維化型成纖維細胞。
　　 2、ITGB4BP抑制肌成纖維細胞的生物學

10、功能
　　 ITGB4BP強制高表達于增生性瘢痕來源的成纖維細胞后，我們利用Real-Time PCR技術和Western Blotting技術分別從mRNA水平和蛋白水平檢測α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)、TGF-β1(轉(zhuǎn)移生長因子-β1)、CollagenⅠ(Ⅰ型膠原)的變化，并且利用FPCL(Fibroblasts Populated Collagen Lattice，成纖維細胞膠原網(wǎng)架系統(tǒng))模型檢測膠原收縮。結(jié)果表明：

11、ITGB4BP能夠抑制α-SMA、TGF-β1和CollagenⅠ的表達，同時抑制FPCL模型中凝膠的收縮。提示ITGB4BP具有使肌成纖維細胞去分化作用。
　　 我們利用TGF-β1抗體封閉TGF-β1信號通路后，利用FPCL模型觀察到ITGB4BP仍能抑制膠原的收縮，提示ITGB4BP抑制膠原收縮存在非TGF-β1依賴機制，因此我們利用免疫共沉淀釣出ITGB4BP相互作用蛋白，通過質(zhì)譜技術篩選出ITGB4BP相互作用蛋白α3

12、-Catenin。
　　 3、ITGB4BP抑制纖維化動物模型的纖維增生
　　 由于目前缺乏理想的增生性瘢痕動物模型，所以我們利用大鼠背部皮膚線性切口模型和CCL4誘導大鼠肝纖維化動物模型來觀察創(chuàng)面愈合后肉芽組織的多少和肝纖維化后膠原纖維的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在線性切口模型中ITGB4BP在創(chuàng)傷后第7天能明顯減少大鼠背部皮膚線性切口后的瘢痕面積，在肝纖維化模型中ITGB4BP能有效降低大鼠肝纖維化后膠原的比例。
　　

13、終上所述，本課題首先根據(jù)ITGB4BP在正常皮膚組織和增生性瘢痕組織中的表達分布特點，提示胞漿ITGB4BP陽性的成纖維細胞是生理型成纖維細胞，參與形成正常皮膚的真皮層，胞漿ITGB4BP陰性的細胞是纖維化型成纖維細胞，參與形成增生性瘢痕的真皮層。其次通過強制高表達ITGB4BP，從體外實驗初步闡明了ITGB4BP一方面特異性下調(diào)TGF-β1蛋白的表達，抑制TGF-β1-Smad信號的傳導，使增生性瘢痕內(nèi)肌成纖維細胞的表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表達

14、α-SMA、分泌Ⅰ型膠原降低，細胞收縮能力受到抑制，從而抑制增生性瘢痕的形成。另一方面作用于胞漿中的α3-Catenin參與調(diào)節(jié)β-catenin信號通路，影響增生性瘢痕相關基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯和細胞-細胞粘附。最后通過體內(nèi)纖維化動物模型證明ITGB4BP能相對量地(非絕對量)控制纖維化，縮短創(chuàng)面愈合時間。因此，我們研究提示ITGB4BP通過TGF-β1信號通路和β-Catenin信號通路抑制肌成纖維細胞的生物學功能，逆轉(zhuǎn)成纖維細胞向肌成纖