腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來源的外泌體在肝癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制的研究.pdf

1、背景：肝細(xì)胞肝癌是預(yù)后較差的一類腫瘤，其致死率居所有腫瘤的第三位。肝細(xì)胞肝癌的致病因素十分復(fù)雜，主要包括病毒、真菌感染、酒精等因素導(dǎo)致基因突變，原癌基因激活，抑癌基因沉默。近十幾年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展并不僅僅是腫瘤細(xì)胞本身癌基因或是抑癌基因的改變，腫瘤周圍的微環(huán)境同樣作為“共犯”參與了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤的微環(huán)境中主要的細(xì)胞種類可以分為3類：血管生成細(xì)胞，浸潤的免疫細(xì)胞，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞。這三類細(xì)胞均能夠與腫瘤細(xì)胞通過相互作

2、用，參與對腫瘤細(xì)胞“腫瘤印記”的改變過程。
　　腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中一類重要的非實質(zhì)細(xì)胞，高表達alpha-SMA和纖維活化蛋白FAP，分泌多種細(xì)胞因子如HGF，EGF，IGF，F(xiàn)GF，SDF-1等參與腫瘤細(xì)胞增殖和EMT轉(zhuǎn)化過程，并能夠通過分泌大量的基質(zhì)成分、膠原和纖黏連蛋白等參與腫瘤微環(huán)境的重塑。
　　外泌體是一種直徑在30-150nm的囊泡結(jié)構(gòu)，其中包含多種內(nèi)容物，如蛋白質(zhì)（細(xì)胞因子，膜受體，受體的配體等

3、等），核酸類物質(zhì)（如DNA，mRNA，miRNA, LncRNA）以及脂質(zhì)，其組成成分能夠影響受體靶細(xì)胞。近年來的研究表明，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞能夠通過分泌外泌體與腫瘤細(xì)胞相互交流。而腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞與正常成纖維細(xì)相比其miRNA的表達譜差異十分明顯。那么腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來源的外泌體中miRNAs是否同樣存在不同的表達豐度，是否參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變？
　　目的：
　　1.探討肝癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞

4、與癌旁組織中成纖維細(xì)胞來源外泌體中的miRNAs的差異表達情況，并篩選出候選miRNA進行功能學(xué)驗證
　　2.探討差異表達的miR-320a對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)表型的影響
　　3.研究miR-320a參與調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性改變的分子機制
　　方法：
　　1.首先分離6對肝癌及癌旁組織中原代的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和癌旁成纖維細(xì)胞（PAFs），通過提取兩種成纖維細(xì)胞分泌的外泌體，通過PCR擴增獲取最終的Cdn

5、a文庫，進而對其中的miRNAs進行miRNAs測序后篩選出了差異表達的miRNA。
　　2.通過體外共培養(yǎng)和體內(nèi)裸鼠皮下成瘤，在CAFs中過表達miR-320a，觀察是否能夠通過外泌體傳遞至肝癌細(xì)胞并發(fā)揮功能。
　　3.利用慢病毒在肝癌細(xì)胞系中過表達miR-320a，通過CCK-8，平板克隆，Transwell及劃痕實驗驗證，miR-320a對肝癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響。
　　4.通過體內(nèi)皮下成瘤實驗，檢測miR-32

6、0a對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；通過裸鼠尾靜脈，檢測miR-320a對肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　5.利用生物信息預(yù)測軟件結(jié)合熒光素酶報告基因檢測驗證miR-320a的靶基因。通過western blot，免疫組織化學(xué)和原位雜交試驗，驗證miR-320a下游分子通路。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)了肝癌組織來源的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）及癌旁組織成纖維細(xì)胞（PAFs），并對其生物學(xué)特征及表面分子標(biāo)記進行了驗

7、證。相對于PAFs，CAFs細(xì)胞表達更強的alpha-SMA和FAP，但是PDGF-beta的表達并無明顯的差異。成功分離了CAFs及PAFs細(xì)胞分泌的外泌體，并對其進行了鑒定。通過構(gòu)建miRNAs文庫，進行測序。測序結(jié)果表明CAFs來源的外泌體中存在大量下調(diào)的促腫瘤miRNAs。共有42個下調(diào)，2個上調(diào)miRNA存在顯著性差異，通過比較差異表達的miRNAs的表達量及差異倍數(shù)，最終篩選出miR-320a作為后續(xù)研究。
　　2.通

8、過體外間接共培養(yǎng)模型證實，成纖維細(xì)胞能夠?qū)y3標(biāo)記的miR-320a通過外泌體轉(zhuǎn)運至肝癌細(xì)胞，在肝癌細(xì)胞中表達紅色熒光。將過表達miR-320a的成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，qRT-PCR結(jié)果提示，MHCC97-H細(xì)胞中miR-320a的表達上調(diào)。同時體內(nèi)實驗證實，過表達miR-320a的成纖維細(xì)胞能夠在體抑制肝癌細(xì)胞的成瘤，小動物活體成像結(jié)果提示熒光強度明顯低于對照組。
　　3.通過CCK-8、平板克隆實驗證實過表達miR-3

9、20a后能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力；miR-320a能夠是肝癌細(xì)胞系細(xì)胞周期阻滯于G1期。通過Transwell及劃痕實驗證實過表達miR-320a后能夠抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進一步裸鼠成瘤實驗，及裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型證實了體外實驗的結(jié)論。
　　4.利用生物分析軟件(TargetScan,CLIP-Seq,miRDB and miRanda)預(yù)測了miR-320a的下游靶基因PBX3。通過恢復(fù)性實驗驗證證實，miR-320a

10、能夠通過PBX3參與調(diào)控肝癌細(xì)胞MHCC97-H和SMM7721的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進一步證實，PBX3可以通過影響ERK1/2磷酸化水平，參與調(diào)節(jié)了CDK2，MMP2以及EMT的相關(guān)標(biāo)記物的表達。
　　綜上，我們認(rèn)為腫瘤組織中CAFs分泌外泌體中的miR-320a表達下降，會引起其中的促腫瘤成分和抑腫瘤成分的平衡失調(diào)，為肝癌細(xì)胞提供了更有利于其生長轉(zhuǎn)移的環(huán)境，進而介導(dǎo)肝癌的惡性轉(zhuǎn)變。而通過在CAFs中過表達miR-320a能