亞硒酸鈉對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　觀察亞硒酸鈉對人增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HS)成纖維細(xì)胞(Fibroblast,FB)體外增殖的影響,并進(jìn)一步研究經(jīng)亞硒酸鈉作用后的 FB中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor beta-1,TGF-β1)和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的變化;探討在亞硒酸鈉作用FB過程中Wnt/β-catenin信號通路的變化,從而證明亞硒酸鈉抑制HS中FB增殖的可能作用機(jī)制。
　

2、　方法:
　　(1)HS組織取自本院整形科患者,采用改良組織塊聯(lián)合胰酶消化法體外培養(yǎng)FB;(2)取第4代FB用CCK-8試劑檢測經(jīng)過不同濃度(0 umol/L、2.5umol/L、5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L、80 umol/L)的亞硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、48h、72h、96h之后各組FB的增殖情況;同等條件下,用Live/dead試劑盒檢測加入不同濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)24h之

3、后在熒光顯微鏡下觀察各組FB生長情況;細(xì)胞免疫組化法檢測加入上述不同濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后各組FB內(nèi)TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原,Wnt-1和β-catenin蛋白的表達(dá)情況;采用蛋白免疫印跡法檢測加入上述不同濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后各組FB內(nèi)Wnt-1和β-catenin蛋白的表達(dá)情況,以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次;(3)日本大耳白兔8只,建立兔耳HS的動物模型,每只兔子每只耳朵上分別建立6個1.0cmx1.0cm創(chuàng)面,28

4、天后取已形成的60個HS創(chuàng)面隨機(jī)分為三組:A:生理鹽水組,B:0.1mg/ml醋酸曲安奈德組,C:20umol/L(考慮亞硒酸鈉的毒性作用,本次選取一個相對安全適中的濃度)亞硒酸鈉組,進(jìn)行干預(yù),在瘢痕組織塊基底部每次注射上述相應(yīng)溶液50ul,每3天一次,總共10次,連續(xù)性觀察瘢痕的形態(tài)學(xué)變化;30天后切下標(biāo)本隨后進(jìn)行蘇木精一伊紅染色觀察各組瘢痕FB數(shù)量和膠原表達(dá)及排列變化。
　　結(jié)果:
　　(1)亞硒酸鈉在0-80 umol

5、/L濃度范圍內(nèi),在同一時間內(nèi)隨著濃度的增加,對 FB的抑制率呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(P<0.05);在相同濃度作用下隨著時間的延長,亞硒酸鈉對FB的抑制率逐漸增加(P<0.05);(2)Live/dead試劑檢測結(jié)果示,在0-40 umol/L濃度內(nèi),隨著濃度的上升,鏡下可見死細(xì)胞數(shù)逐漸增加;(3)細(xì)胞免疫組化顯示在亞硒酸鈉0-40 umol/L濃度內(nèi),隨著濃度的上升, FB內(nèi)TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原、wnt-1以及β-catenin蛋白

6、表達(dá)逐漸減弱,并且陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少(P<0.05);(4)蛋白免疫印跡結(jié)果顯示隨著亞硒酸鈉的濃度在0-40 umol/L范圍內(nèi)增加,wnt-1和β-catenin蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05);(5)傷后7天兔耳創(chuàng)面已基本結(jié)痂,14天創(chuàng)面基本愈合,28天后96個創(chuàng)面中只有60個創(chuàng)面形成達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的HS創(chuàng)面;與生理鹽水組比較,亞硒酸鈉組、醋酸曲安奈德組瘢痕顏色變淡、厚度變薄并且質(zhì)地變軟,而且亞硒酸鈉組瘢痕形態(tài)學(xué)上的改善優(yōu)于醋酸曲安奈

7、德組;蘇木精一伊紅染色示HS組織內(nèi)FB數(shù)量明顯高于正常皮膚并且排列紊亂,亞硒酸鈉組、醋酸曲安奈德組較生理鹽水組FB數(shù)量明顯減少,其中亞硒酸鈉組瘢痕FB減少較醋酸曲安奈德組更明顯。
　　結(jié)論:
　　(1)亞硒酸鈉在體外能抑制人HS中FB的增殖,并且可以降低FB內(nèi)TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原、wnt-1以及β-catenin蛋白的表達(dá),其對抑制HS增生有積極的作用;(2)亞硒酸鈉在抑制人HSFB的增殖過程中,對Wnt/β-cate