大鼠骨髓間充質干細胞影響心臟成纖維細胞合成基質金屬蛋白酶及其相關機制研究.pdf

1、實驗背景:
　　 心肌梗死(myocardial infarction,MI)后繼發(fā)心肌細胞代償性肥大、細胞壞死或凋亡以及細胞外基質成分改變,心室大小、形狀、室壁厚度和組織結構等產生一系列變化,這一病變修復和心室整體代償及繼發(fā)的病理生理反應過程稱為心室重構。MI后心室重構常常導致心臟舒縮功能障礙、心律失常等,是引起心力衰竭的主要原因。目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高,為目前全球范圍內致死和致殘的主要疾病之一。
　　 近年

2、來藥物治療和介入治療得到了快速發(fā)展,缺血性心肌病患者的預后有了明顯的改善,但藥物治療和介入治療終歸不能修復壞死的心肌。隨著對干細胞(slemcells)研究的不斷加深,認為干細胞具有組織再生的功能,在體內能分化成為其他成熟細胞。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力和橫向分化能力,移植到心梗局部后能夠分化為內皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌細胞樣細胞,促進新生血管的形成。大量的研究,包括基

3、礎研究和臨床前期研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠挽救瀕死的心肌,減少心梗面積,改善心室重構進而提高心功能。然而MSCs如何改善心梗后心室重構的分子機制尚不明確。
　　 以往有研究顯示移植后MSCs通過降低心肌組織中基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)的合成和活性來改善心室重構。MMPs是一組能特異的降解細胞外基質成分的酶家族,能使膠原纖維降解增加,心肌膠原結構受到破壞,使左室的大小和形狀發(fā)生改變,最終

4、影響心肌的收縮力?；|金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是MMPs特異性的內源性抑制劑。而心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)是心臟中分泌和合成MMPs和TIMPs的主要細胞。因此,我們推測,MSCs可能通過旁分泌作用影響CFs合成和分泌MMPs,從而起到改善心室重構的作用。
　　 實驗目的:研究體外MSCs能否通過旁分泌

5、作用影響CFs的MMPs的合成,并對可能的作用機制進行探討。
　　 實驗方法:體外模擬心肌梗死,建立缺氧模型,CFs分為正常對照組(CFs),缺氧組(H-CFs),MSCs共培養(yǎng)組(H-CFs-MSCs)以及缺氧預處理MSCs共培養(yǎng)組(H—CFs-HMSCs)共四組。應用明膠酶譜的方法檢測四組MMP-2及MMP-9的活性變化。Western-blot檢測MSCs與H-CFs共培養(yǎng)后,能否減弱H-CFs的MMP-2、MMP-9、M

6、T1-MMP(membrane type1-MMP)及TIMP-1的合成。在MSCs(或H-MSCs)和H-CFs的共培養(yǎng)基中加入促紅細胞生成素可溶性受體(erythropoietin soluble receptor,EPOsR)或者促紅細胞生成素中和性抗體(erythropoietin neutralizing antibody,EPOAb),再次采用明膠酶譜以及Western-blot方法檢測上述指標變化。我們進一步采用Weste

7、rn-blot檢測了與MMPs的合成、缺氧以及EPO密切相關的信號通路ERK1／2和AKT的變化。
　　 實驗結果:明膠酶譜結果顯示,CFs缺氧24小時處理后(H-CFs)分泌的MMP-2活性比CFs的明顯增高；H-CFs分別與MSCs和HMSCs共培養(yǎng)后(H-CFs-MSCs,H—CFs—HMSCs),MMP-2的活性又降低；而MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四組中均沒有明顯變化。W

8、estern-blot結果顯示H-CFs中MMP-2蛋白表達較CFs明顯增高(P<0.01),共培養(yǎng)組H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs的MMP-2的表達又下降。MT-1MMP在MMP-2的激活過程中起著協(xié)同作用,因此我們也檢測了MT1-MMP的表達,發(fā)現(xiàn)MT1-MMP的變化與MMP-2的變化一致。H-CFs中的TIMP-1蛋白水平比CFs的明顯降低,共培養(yǎng)組H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs中的TIMP-1表達又增

9、加。與明膠酶譜的結果一致,在MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四組中均沒有明顯變化。在共培養(yǎng)基中加入EPOsR或者EPOAb,均能逆轉MSCs和HMSCs對H-CFs合成MMPs的變化。缺氧能夠明顯增加CFs中的ERK1／2的磷酸化水平,MSCs共培養(yǎng)能夠減少ERK1／2的磷酸化表達水平；EPO阻滯劑EPOsR和EPOAb均能逆轉MSCs共培養(yǎng)對CFs中磷酸化ERK1／2的影響,而AKT信號通路

10、無明顯變化。在我們的研究中,MSCs和HMSCs對CFs合成MMPs的影響無明顯區(qū)別。
　　 實驗結論:
　　 1.MSCs能通過旁分泌作用減少缺氧后CFs的MMP-2、MT1-MMP的表達,增加TIMP-1表達。
　　 2.EPO在MSCs對CFs合成MMP和TIMP-1的旁分泌作用中是一個關鍵的細胞因子。
　　 3.ERK1／2信號通路在MSCs影響CFs的MMP和TIMP-1的合成中發(fā)揮了重要作用。