低劑量棉酚和甾體激素聯(lián)合用藥對(duì)大鼠精子發(fā)生的影響.pdf

1、女性避孕藥已經(jīng)成功應(yīng)用了六十多年，但至今仍無(wú)安全、有效、無(wú)副作用的男性避孕藥面市。目前處于研究階段的男性避孕藥主要以甾體激素類(lèi)藥物為主，但其不能完全有效、起效時(shí)間長(zhǎng)、用藥方式（注射或皮下植入）不便等，為其推廣造成了很大障礙。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多年研究，發(fā)現(xiàn)低劑量棉酚與甾體激素聯(lián)合應(yīng)用可以使大鼠較快、較好地達(dá)到抗生育效果，同時(shí)避免了單獨(dú)使用其中一種可能造成的一系列副作用的出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)多年篩選，我們確定了低劑量棉酚與可口服的甾體激素——去氧孕烯+炔

2、雌醇+十一酸睪酮的聯(lián)合用藥方案。這個(gè)方案既能使全部受試大鼠在8w內(nèi)達(dá)到不育，又無(wú)明顯的毒副作用，但其作用靶點(diǎn)尚未闡明。
　　 大鼠隨機(jī)分為四組，喂服棉酚12.5mg/kg·d+去氧孕烯0.125mg/kg·d+炔雌醇0.025mg/kg·d+十一酸睪酮100mg/kg·d的聯(lián)合用藥組（GH組），單獨(dú)喂服相同劑量的棉酚組（G組）、單獨(dú)喂服相同劑量的激素組（H組）以及喂服載體溶劑的陰性對(duì)照組（C組）。分別于用藥后4、6、8和10w取

3、材，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、組織勻漿計(jì)數(shù)精子數(shù)量、免疫組化染色、TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)、油紅O染色、Western blotting、RT-PCR及體外培養(yǎng)生精小管等多種方法，分別對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中可能受到干擾的環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果的比較，探討聯(lián)合用藥抗生育的具體作用環(huán)節(jié)以及棉酚和激素在用藥過(guò)程中各自所起的作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn): GH組每克睪丸組織所含的精子數(shù)量隨用藥時(shí)間增加而明顯下降，從4w時(shí)的與C組水平相當(dāng)下降到10

4、w時(shí)的只有C組的26.4％;H組的精子數(shù)量下降的幅度雖然比GH組小，但到10w時(shí)數(shù)值已與GH組接近;而G組一直沒(méi)有明顯變化。對(duì)睪丸組織切片的觀察也證實(shí)GH組和H組的生精細(xì)胞隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加而逐漸減少，尤其以長(zhǎng)形精子細(xì)胞最為明顯。8w時(shí)GH組近一半的生精小管中不含長(zhǎng)形精子細(xì)胞，而此時(shí)H組大約只有10％的小管出現(xiàn)改變。到10w時(shí)H組長(zhǎng)形精子細(xì)胞的數(shù)量明顯下降， GH組和H組之間的差異消失。此外，GH組和H組的初級(jí)精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞的數(shù)

5、量也不斷減少。與此同時(shí)，我們觀察到GH組和H組附睪頭內(nèi)的成熟精子數(shù)量明顯減少，卻有大量圓形的生精細(xì)胞出現(xiàn)。G組的睪丸精子數(shù)量以及睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)方面都未見(jiàn)與C組有明顯差別。以上結(jié)果提示，GH組和H組的生精過(guò)程受到了干擾，致使發(fā)育到成熟階段的精子數(shù)量下降。
　　 通過(guò)對(duì)生精細(xì)胞增殖情況的檢查，發(fā)現(xiàn)各用藥組Ⅶ-Ⅷ期生精小管中的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞（精原細(xì)胞和細(xì)線前期的初級(jí)精母細(xì)胞）的數(shù)量基本無(wú)明顯變化，說(shuō)明三個(gè)用藥組中精原細(xì)胞的增殖、分化未

6、受到明顯抑制。
　　 TUNEL染色檢查凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)從4w開(kāi)始GH組和H組的凋亡細(xì)胞就明顯增多，而且隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，10w時(shí)已分別達(dá)到C組的66倍和55.8倍了。凋亡主要發(fā)生在Ⅶ-Ⅷ期生精小管，主要的凋亡細(xì)胞種類(lèi)為粗線期初級(jí)精母細(xì)胞，另外也有一些圓形精子細(xì)胞發(fā)生凋亡。GH組與H組的多個(gè)結(jié)果相近，比如凋亡細(xì)胞的總數(shù)、主要凋亡細(xì)胞類(lèi)型和凋亡發(fā)生的主要階段等，但Ⅸ-Ⅵ期生精小管中GH組的凋亡細(xì)胞比H組多。這說(shuō)明GH組的細(xì)胞凋亡

7、可能主要是激素作用導(dǎo)致的，而棉酚可能在此基礎(chǔ)上有強(qiáng)化作用。G組凋亡細(xì)胞的數(shù)量與C組相近，另外整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞凋亡。GH組和H組生精細(xì)胞大量凋亡可能是這兩組生精上皮中細(xì)胞減少的原因之一。
　　 支持細(xì)胞有吞噬并降解凋亡細(xì)胞的能力，生精上皮內(nèi)的脂滴增多常意味著被吞噬的凋亡細(xì)胞增多。油紅O染色結(jié)果顯示GH組和H組生精上皮中的脂滴面積明顯增多，而G組的脂滴面積沒(méi)有發(fā)生明顯改變。該結(jié)果間接證明GH組和H組大

8、量凋亡的細(xì)胞被支持細(xì)胞所吞噬，支持細(xì)胞的吞噬能力未受到明顯抑制。
　　 GH組和H組附睪管中出現(xiàn)的大量圓形生精細(xì)胞，提示生精細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的粘附可能發(fā)生改變，致使大量未成熟的生精細(xì)胞提前脫落，因此我們對(duì)部分粘附分子在睪丸內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示:GH組和H組的N-鈣粘蛋白的蛋白表達(dá)水平升高，并有隨時(shí)間繼續(xù)上升的趨勢(shì)，尤其以生精上皮中間層細(xì)胞（圓形精子細(xì)胞或初級(jí)精母細(xì)胞）之間的

9、表達(dá)增加得更為明顯。RT-PCR檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)這兩組的N-鈣粘蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平在8w時(shí)比C組高，但各組間沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，免疫組化結(jié)果顯示:整合素α6在GH組和H組的Ⅳ-Ⅷ期小管中圓形精子細(xì)胞之間的表達(dá)也隨時(shí)間增加而不斷增強(qiáng)。但是，整合素β1的變化趨勢(shì)與以上兩種粘附分子不同，它在GH組和H組生精上皮中間層的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中GH組下降的幅度更大。G組除了在Ⅸ-(XIV)期小管初級(jí)精母細(xì)胞的表達(dá)明顯比C組低外，其它階段都與C組類(lèi)似。

10、以上3個(gè)粘附分子中只有整合素β1在中間層生精上皮的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，提示整合素β1與生精細(xì)胞的脫落關(guān)系更為密切，而N-鈣粘蛋白和整合素α6的表達(dá)增加可能是由于生精細(xì)胞大量脫落而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)的代償反應(yīng)。GH組比H組更為明顯的整合素β1的表達(dá)減少則提示棉酚可能在激素影響粘附分子表達(dá)的基礎(chǔ)上有進(jìn)一步的協(xié)同作用。
　　 我們?cè)诓G丸組織切片還觀察到4-6W時(shí)，GH組和H組位于Ⅶ-Ⅷ期生精小管腔面的19期精子細(xì)胞明顯減少，但Ⅸ-Ⅺ期的小管腔面

11、卻又有一些精子細(xì)胞未能釋放;與此同時(shí)，Ⅶ-Ⅻ期生精上皮的基底部精子頭的數(shù)量明顯比C組多。G組一直沒(méi)有明顯改變。以上結(jié)果提示GH組和H組的19期精子細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的粘附可能發(fā)生改變，或者19期精子細(xì)胞本身出現(xiàn)異常而被支持細(xì)胞大量吞噬。無(wú)論哪個(gè)原因都可以造成管腔面19期精子細(xì)胞數(shù)量的減少，而這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能主要是激素作用的結(jié)果。TUNEL法未檢測(cè)到長(zhǎng)形精子細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、另外我們也未發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的3個(gè)粘附分子在19期精子細(xì)胞周?chē)忻黠@改變

12、，此處發(fā)生的改變還需要進(jìn)一步檢測(cè)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低激素水平可以促使19期精子細(xì)胞從培養(yǎng)的正常生精小管脫落，其中GH組（培養(yǎng)液中含棉酚）的變化最為明顯，提示棉酚在激素作用的基礎(chǔ)上有協(xié)同促使19期精子細(xì)胞提前脫落的效應(yīng)。
　　 我們對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)家族MAPKs的3個(gè)成員的活化形式——p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探索細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子上述改變中的作用。結(jié)果顯示GH組和H組p-ERK在支持細(xì)胞的表達(dá)增加、

13、p-p38 MAPK在圓形精子細(xì)胞之間的表達(dá)增加，而p-JNK在無(wú)長(zhǎng)形精子細(xì)胞的生精上皮中未見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。p-ERK和p-p38MAPK在GH組和H組的表達(dá)變化分別與粘附分子N-鈣粘蛋白和整合素α6的表達(dá)變化有一定相似之處，提示它們可能參與細(xì)胞粘附改變的調(diào)節(jié)，但這還需要大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。3個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)在G組未出現(xiàn)明顯改變。
　　 以上睪丸的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中GH組的數(shù)據(jù)多與H組較為接近，并與C組間存在顯著差異;另外GH組常比H組

14、更早出現(xiàn)與C組間的差距，且差距也比H組大;G組的結(jié)果則多與C組相近，二者間多無(wú)顯著差異。這說(shuō)明聯(lián)合用藥在睪丸中以激素發(fā)揮主要作用，棉酚在此基礎(chǔ)上有協(xié)同作用。二者通過(guò)促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡、影響粘附分子的表達(dá)而增加生精細(xì)胞的脫落、增加長(zhǎng)形精子細(xì)胞提前釋放或被吞噬等，最終導(dǎo)致睪丸的精子產(chǎn)量大幅度下降。
　　 在附睪中，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的精子數(shù)量和活力隨用藥時(shí)間增加而明顯下降，10w時(shí)G組、H組和GH組附睪的精子數(shù)量分別只有C組的44.41％、4

15、0.16％和15.43％;同時(shí)，G組和H組分別只有14.00％和15.67％的可游動(dòng)精子，而GH組基本未見(jiàn)可游動(dòng)精子。另外各用藥組的精子畸形率也都在不斷增加，其中GH組的畸形精子出現(xiàn)得最早(4w)、數(shù)量也最多，10w時(shí)精子的畸形率高達(dá)91.17％，此時(shí)G組和H組的畸形率也分別達(dá)到了54.67％和63.83％。各組精子出現(xiàn)畸形的部位不完全相同:H組以精子頭尾分離為主;而G組除了有頭尾分離的精子外，尾部結(jié)構(gòu)不完整（線粒體鞘不完整、軸絲脫出、

16、尾部折斷等）的精子也在不斷增加;GH組的精子畸形則先以尾部異常為主，隨后頭尾分離的精子大量增加。各實(shí)驗(yàn)組均未發(fā)現(xiàn)頭部異常的精子，附睪管上皮的形態(tài)也未發(fā)現(xiàn)明顯改變。
　　 附睪的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中GH組與C組間的差異最大，而G組和H組的數(shù)值常較為接近、并介于GH組與C組之間，提示棉酚和激素在附睪中都發(fā)揮作用、但作用的位點(diǎn)可能各不相同。在這兩種藥物的作用下，聯(lián)合用藥組的精子數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)能力等都出現(xiàn)大幅度地改變。
　　 總之，

17、無(wú)論在睪丸還是在附睪，棉酚和激素都發(fā)揮重要作用。在睪丸中以激素的作用為主、棉酚有進(jìn)一步協(xié)同的效果;而在附睪中二者的作用相當(dāng)。通過(guò)棉酚和激素在睪丸和附睪中的多個(gè)環(huán)節(jié)的綜合作用，最終更快、更有效地降低了成熟精子的數(shù)量及其運(yùn)動(dòng)能力，達(dá)到比單獨(dú)使用其中任何一種更好的避孕效果。
　　 本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)角度對(duì)聯(lián)合用藥可能在大鼠生精過(guò)程中造成的影響進(jìn)行了詳細(xì)、系統(tǒng)地觀察和分析，并在此基礎(chǔ)上從粘附分子的角度對(duì)生精細(xì)胞脫落的可能原因進(jìn)行了初步探索，