TLR3在HBV感染誘導(dǎo)的抗病毒免疫中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的：探討 TLR3 表達(dá)和 TLR3-TBK1-IRF3-IFN-β信號(hào)傳導(dǎo)通路與乙型肝炎病毒感染后宿主免疫清除障礙的關(guān)系. 方法選取HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者58例,健康對(duì)照者55例,用免疫磁珠細(xì)胞分選(Magnetic Cell Sorting,MACS)法獲得純化的CD14<'+>的單核細(xì)胞,用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并且用hGM-CSF、hIL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞成為未成熟的mDC,加入polyI:C(25μg/ml)刺

2、激后,獲得成熟的mDC,通過(guò)細(xì)胞的形態(tài)及表面特異性分化抗原的表達(dá)檢測(cè)來(lái)測(cè)定mDC的純度.在polyI:C刺激后0h、12h、24h、48h收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液及細(xì)胞,用FACS檢測(cè)細(xì)胞的受體TLR3及表面分化抗原CD86、HLA-DR、CDla的表達(dá),Real-Time PCR方法檢測(cè)TLR3 mRNA及其信號(hào)傳導(dǎo)通路中TBKl、IFR3、IFN-β mRNA的表達(dá),用ELISA方法檢測(cè)mDC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-β、IL-1

3、2、IL-10的濃度變化. 結(jié)果 1.用CD14 磁性微珠能獲得高純度的外周血CD14<'+>單核細(xì)胞,以hGM-CSF、hIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)可以獲得高純度的形態(tài)、表型及功能均典型的mDC.2.健康對(duì)照組中mDC經(jīng)polyI:C(25μg/ml)刺激后24h TLR3表達(dá)上調(diào),與oh相比有顯著性差異(P<0.05),48hTLR3表達(dá)較24h下降,與0小時(shí)相比無(wú)顯著性差異.而患者組的12h、24h TLR3的表達(dá)上調(diào)不明顯,與Oh

4、相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),48h TLR3表達(dá)上調(diào)顯著(P<0.05).Real-Time PCR檢測(cè)DC上TLR3 mRNA結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組TLR3 mRNA12h的表達(dá)水平較Oh表達(dá)水平顯著上升(I)<0.05),顯著高于患者組oh、12h、24h的表達(dá)水平.患者組48h的表達(dá)水平較Oh表達(dá)水平顯著上升(P<0.05).與Oh比較,健康對(duì)照組12h、24h、48h的CD86的表達(dá)上升值較患者組顯著(P<0.05).二組之間C

5、Dla、HLA-DR的表達(dá)無(wú)顯著性差異. 3.二組mDC上TBKl mRNA Oh的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05).患者組mDC經(jīng)polyI:C刺激后12h、24h、48h TBKl mRNA的表達(dá)上升不明顯,與Oh相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)o而健康對(duì)照組mDC經(jīng)polyI:C刺激后12h TBKl mRNA的表達(dá)水平較Oh顯著升高(P<0.05),而24h、48h TBKl mRNA表達(dá)水平較12h下降,與oh相比無(wú)

6、顯著性差異(P>0.05).與TBKl mRNA的表達(dá)一致,患者組mDC中IRF3 mRNA的表達(dá)沒(méi)有隨時(shí)間變化,而健康對(duì)照組mDC經(jīng)polyI:C刺激后12h IRF3mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),24h、48h IRF3 mRNA表達(dá)水平較12h下降,但48h仍然顯著高于Oh的表達(dá)水平(P<0.05).4.用RT-PCR法檢測(cè)mDC中IFN-βmRNA的表達(dá),同時(shí)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中IFN-β的濃度.

7、二組mDC上IFN-β mRNA及IFN-βOh的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05).患者組mDC經(jīng)polyI:C刺激后12h、24h、48h IFN-β mRNA及IFN-β的濃度與Oh相比沒(méi)有顯著變化,而健康對(duì)照組mDC經(jīng)polyI:C刺激后12h IFN-β mRNA的表達(dá)水平與Oh相比顯著升高(P<0.05).同樣,健康對(duì)照組12h IFN-β的濃度與Oh相比較有顯著性上升(P<0.05),較患者組Oh、12h、24h、48h I

8、FN-β的濃度顯著升高(P<0.05). 5.二組IL-10及IL-12Oh的濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05),患者組IL-1024h及48h的濃度與Oh相比明顯上升(P<0.05),較對(duì)照組Oh、12h、24h、48h顯著升高(P<0.05),而對(duì)照組12h、24h、48h IL-10的濃度沒(méi)有明顯上升.與之相反,患者組12h、24h、48h IL-12的濃度與Oh相比沒(méi)有明顯上升,對(duì)照組在12h IL-12濃度上升明顯,與O

9、h相比較有顯著性差異(P<0.05),24h、48h IL-12的濃度繼續(xù)升高(P<0.05),較患者組Oh、12h、24h、48h的濃度顯著升高(P<0.05). 結(jié)論從人外周血單核細(xì)胞能穩(wěn)定地誘導(dǎo)擴(kuò)增出大量高純度的mDC.本研究結(jié)果提示慢性乙型肝炎患者mDC受到刺激后TLR3表達(dá)上調(diào)延遲,協(xié)同刺激因子CD86表達(dá)低下.TLR3的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路中TBKl、IRF3的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者mDC受到dsRNA刺激后TBK

10、1、IRF3 mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著上調(diào),提示TLR3受到配體刺激后信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙.IFN-β的檢測(cè)結(jié)果也表明慢性乙型肝炎患者受到刺激后IFN-β mRNA沒(méi)有顯著上調(diào),IFN-β的濃度沒(méi)有升高,導(dǎo)致患者不能有效的清除病毒.細(xì)胞因子IL-12和IL-10的結(jié)果顯示慢性乙型肝炎患者分泌IL-12水平低下,而IL-10明顯高于健康對(duì)照者,患者感染HBV后T細(xì)胞向Th1分化受到抑制,而向TH2分化加強(qiáng),故不能有效激活特異性抗病毒免疫,使機(jī)體